调控睡眠和做梦的基因：日本科学家的最新发现
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编者按：
今年10月初日本大隅良典获得其本世纪第17个自然科学诺奖引起很多中国人的感慨和思考，而11月第一期的《自然》又刊出日本筑波大学科学家柳沢正史教授发现哺乳类控制睡眠的基因。无独有偶，与大隅良典诺奖工作一样的是，柳沢正史等也用遗传筛选。
二十多年前日本科学家是用单细胞生物酵母研究细胞水平的生物学问题（细胞内自噬），而现在日本科学家是用比酵母高等很多的老鼠研究系统水平的生物学问题（生物体睡眠）。用脑电图（EEG）作为检测睡眠的指标，用老鼠筛选基因突变种，耗资多、时间长，需要痛下决心，柳沢正史带领他的团队做到了。他们做出了迄今哺乳类睡眠领域最重要的基因水平的发现，刷新了柳沢正史和旅美法国科学家Emmanuel Mignot于1999年分别独立发现神经肽orexin及其受体参与睡眠调控的记录（实验是用小鼠做的，其中睡眠可以检测，但做梦是推测：并没有办法知道小鼠是否做梦）。
这一突破将把睡眠研究提高到什么程度，下面十年我们拭目以待。
撰文 | 鲁伯埙（复旦大学生命科学学院）
责编 | 陈晓雪
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中人有梦君无梦，
乐思幽怀事不同。
为问曲肱高卧日，
如何合眼见周公。
——《赠无梦道人》宋代诗人王遂
清晨醒来，我不禁又陷入了深深的思考，是什么昨晚又让我陷入沉睡，“浪费”了6、7个小时的生命。有人叹，“纸衾瓦枕冷如水，辗转无梦睡不成”；亦有人道：“恋枕嫌多梦，开帘曙色迷”；可谓“中人有梦君无梦，乐思幽怀事不同”。每个人每天都要睡觉，各人睡觉的长短有不少差异，却又在一定的范围之内。控制睡眠的“看不见的手”究竟是什么呢？
我们为什么需要睡眠？
睡眠是一件细思恐极的事情。从低等的无脊椎动物到人类都会进行睡眠。试想一下，人类的祖先或者现在的动物，在睡眠时防御和逃跑能力几乎丧失，对突发的环境变化的适应能力也大大降低，因此极其容易在睡眠中失去生命。另一方面，即使没有上述的危险，睡眠也会造成巨大的代价。如果有方法能够延长一个人十年的寿命，我想大多数人都会愿意用几乎一切代价去换取。然而睡眠累计起来即占据了近三十年的寿命！ 可以看到，睡眠是一个大多数动物都会进行，而代价巨大的行为，所以它也必然是一个至关重要而又收益极大的行为。研究已经发现，长时间缺乏睡眠会导致神经功能下降，甚至猝死。近年来发现睡眠为维持神经可塑性所必须，并且可以帮助大脑“洗澡”从而清除其运作时产生的“垃圾”【1】。宾夕法尼亚大学的Amita Seghal课题组最近还在果蝇模型中发现，睡眠不足会导致产生的后代数目严重减少【2】。“不孝有三，无后为大“。如果Seghal教授的结论能推广至其他动物的话，那么可能可以解释为什么各种动物都有睡眠行为：产生后代的能力是如此重要，以至于影响此能力的基因在进化中会迅速被淘汰，从而消失在历史的长河中。因此，尽管产生睡眠的进化原因还并不完全清晰，睡眠毫无疑问是一种至关重要乃至可能为动物生存繁衍所必须的行为。
睡眠遗传学
睡眠如此重要，但我们对它知之甚少。小时候我就经常梦想有一个开关，把它开了，人就醒了，把它关上，人就睡着了。长大了，对科学有一定了解之后，我知道了有一些控制生物钟的基因，它们通过负反馈控制自身表达量的变化，最终控制动物什么时候睡觉。除了控制什么时候睡，控制睡多长也非常重要。然而控制睡多长的基因有哪些，它们如何工作，我们几乎一无所知。
如果在50年前，我提出“哪些基因控制睡眠时间”这样的问题，大概会被科学界认为是“傻子”（也许比某大国的总统候选人被认为“疯子”或者”骗子“要好一些）。事实上，20世纪60年代，当神经遗传学鼻祖之一Seymour Benzer向加州理工学院的同事阐述神经遗传学（neurogenetics）的想法时，Sydney Brenner（1927-，2002年诺贝尔生理学或医学奖获得者）和Gunther Stent（1924-2008，以细菌新陈代谢研究闻名）等大牛给他的回应是：“怎么可能通过遗传突变体发现大脑如何工作（How was one going to find out anything about how the brain works by studying mutants）？”、“他蠢到家了吗（Was he foolish enough）？”甚至，1971年Seymour Benzer发现第一个控制生物节律行为的基因per的时候，他的同事Max Delbruck还评论说“我一个字也不相信！”（I don’t believe a word of it）——虽然Delbruck后来很快成为Benzer最重要的支持者之一。
随着控制重要神经系统功能（例如生物钟、求偶、记忆等）的重要基因被发现，科学界逐渐承认了复杂的神经功能在很大程度上也受基因控制。
回到睡眠，睡眠的长短又由哪些基因控制呢？逻辑上我们可以用两种方法研究这个问题。我们先根据已有的线索做出猜测，哪些基因可能会影响睡眠的长短。然后使这些基因一个个发生突变，看睡眠长短是不是真的受到影响。这种从特定的基因出发，研究其突变后对表型的影响，就叫做反向遗传学。因为基因是隐藏在表型背后的根本，我们从改变表型背后的根本出发，研究显现出的表型，所以是反向。人和动物大多数都有几万个表达蛋白的基因，还有非常多“非编码”的基因，对于睡眠这样复杂而又所知甚少的行为，从几万个候选基因中直接猜到答案，那得祖坟上冒青烟才会这样幸运，所以反向遗传学要回答睡眠基因是什么这个问题，很可能行不通。
那么用正向呢？如果我们在一大群动物中随机引入基因突变，然后在这些动物中挑选睡眠长短异常的，在这些异常的动物中再寻找是什么突变导致其异常，不就能知道睡眠长短受什么基因影响了吗？这样从表型出发寻找对应的基因突变的思路，符合人们由表及里的认知，就是所谓正向遗传学。
思路有了，那就要建立方法和模型进行实验。我们拿什么动物来研究睡眠的基因呢？要落实到人类的睡眠，最理想的当然是直接拿人来研究。但是人作为研究对象有缺点。首先，无法人为地在人群中主动引入随机突变。尽管人群存在各种基因突变，但是突变程度有限，睡眠长期太短或者太长的人很可能已经被淘汰，而科学家又不能利用药物或辐射去诱发更多的突变，因为诱发突变结果的不可测，没有人会愿意接受自己被诱发基因突变。其次，用人做实验的成本很高。要组织大量的空间及仪器进行观察记录，还要找足够的人配合研究，最后还要做全基因组测序找突变……当然人群的数据还是有用的，比如有些睡眠极少的家族，对我们寻找睡眠基因就非常有帮助。
除了人之外，正向遗传学研究最常用的模式动物之一是果蝇，果蝇可以理解为喜欢吃水果的一种蝇。学过中学生物课的人都知道，摩尔根利用果蝇发现了染色体遗传理论。前文提到的Seymour Benzer也是用果蝇做实验的大家。果蝇在基因操作上有着成熟的系统，特别适合做正向遗传学。此外，果蝇繁殖快，容易短时间内得到足够的数量，适合用于研究表型。
利用果蝇研究睡眠其实在十几年前还是很有争议的事情。笔者2004年还在宾夕法尼亚大学读书的时候，就知道那年有一位大牛实验室发现了控制果蝇睡眠的脑区，投稿给Nature，结果没送审就直接被小编（editor）拒稿了，理由是该领域没有足够的证据表明果蝇会睡眠。大牛很生气，直接打电话给编辑进行了长达一个多小时的“子非蝇，焉知蝇不睡” vs “子非蝇，焉知蝇会睡”的辩论（辩论是有的，内容纯属杜撰）。最后的结果是editor（编辑）把文章送审，而且过了一个多月就发表了。后来，随着证据越来越多，果蝇会睡觉这个结论现在已经没有什么争议了。只是，拿果蝇做睡眠长短的筛选研究还是有局限的。由于果蝇很小而数量多，筛选时基本上只能根据其运动来判断睡眠（比如，果蝇连续5分钟以上不动则被判断为处于睡眠状态）。但是我们知道，人经常会假寐，甚至还会葛优躺，清醒的时候持续5分钟以上不动也是很有可能的。而缩小到果蝇的尺度，它们五分钟不动，却可能没有睡觉，只是假寐或者葛优躺等，但是由于果蝇很小，看不出来这些情形的区别。
尽管有以上的局限，果蝇还是研究睡眠很好的系统，并且为”睡眠遗传学“做出了重要的贡献，比如，第一个睡眠基因shaker就是果蝇中筛选发现的【3】。
小鼠也是做遗传学常用的模式动物。与果蝇相比，小鼠研究睡眠有一大优势：除了观察行为，我们还可以通过测量小鼠的脑电图来判断其是否睡眠。这样测量睡眠的方式更直接，得到的数据更“干净”，并可以区分假寐、葛优躺和真睡，甚至还可以区分做梦与不做梦（脑电图纪录到的REM睡眠在人类与做梦相关，小鼠有REM睡眠，故而有推测也许也与做梦有关——如果小鼠有梦的话）。我们今天将要讨论的文章“Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice（随机突变的小鼠的睡眠的正向遗传学分析）”就是利用小鼠通过正向遗传学筛选发现的新的控制睡眠长短的基因。这个由日本著名学者、筑波大学国际整合睡眠医学研究所所长、医学医疗系教授柳沢正史（Masashi Yanagisawa）带领完成的重要研究刚刚在线发表于Nature【4】。
小鼠睡眠的遗传学筛选
►日本筑波大学教授柳沢正史被视为获得诺贝尔奖的有力人选。来源：www.tsukuba.ac.jp
论文实验部分的第一段就让我震惊了：研究者用化学诱变剂ENU在很多雄性小鼠中诱发了随机的基因突变，然后与野生型雌性小鼠杂交，并测量了杂交所产生的超过8000只子一代小鼠（F1）的睡眠表型。总计上万只小鼠的工作量，光养小鼠就要几百万（人民币）！所以我的小实验室万万不敢想这样的实验的。而且即使我有钱，也不一定做的起来，因为学生可能会跟我说：“我不想养这么多小鼠，我要毕业！” 事实上，根据文章第一作者Funato2013年给我的邮件，他们在3年半以前就已经完成了筛选，而到最近不久才发表文章……我只能感慨一句，真的很佩服这些日本学者！
他们检测小鼠睡眠的方法就是前面提到过的测脑电图。具体来说，他们根据清醒，非眼快动睡眠（NREMS，可以理解为睡着且没有做梦），以及眼快动睡眠（REMS，可以理解为睡着而且做梦）时脑电波的波形特征的不同，测量了每只小鼠在一天24小时内各种状态的时间，并通过大量的测量，找到了睡眠不正常的小鼠。通过这些信息，可以找到睡眠不正常的小鼠家系（pedigree），并且利用这些家系中产生睡眠不正常子代的父亲（父本）的精子做人工授精，进一步验证其基因突变是造成睡眠异常的原因。
明确了突变与睡眠异常的原因之后，就要在基因图谱上找到具体是哪个突变导致的，这个定位的过程叫做mapping。研究者采用了比较巧妙的方法，他们诱变的父本都具有一样的遗传背景（B6J），而杂交用的母本则有另一个遗传背景（B6N）。这两个遗传背景的睡眠没有什么差别，但是两者的基因组在特定的不同位置具有特定的核苷酸，这些位置被称为单核苷酸多态性（SNP）。这些SNP会在子代中按遗传学规律分布，成为了基因组图谱上的“地标“。而比较睡眠异常的子代与正常的子代中SNP分布的不同，就可以找到推断导致睡眠异常的基因的大致位置。再结合全基因组测序，就可以明确是哪个具体位置的突变导致了睡眠异常。用上述方法，柳泽找到了两个睡眠异常的家系 “嗜睡”（Sleepy）和“无梦”（Dreamless），分别对应了两个关键的睡眠基因，Sik3和Nalcn。
“嗜睡”的基因突变
顾名思义，“嗜睡（Sleepy）”意为睡得很长，这一家系的小鼠每天只有524分钟（8.7个小时）是清醒的，远远低于正常小鼠的清醒时间（约13个小时）。进一步分析数据可以发现，嗜睡家系（Sleep）小鼠非快速眼动睡眠（NREMS）时间增加，也就是多睡了，但并没有多做梦。睡得多可能有三个原因，一个是被唤醒的能力差了，比如用闹钟都叫不醒；一个是生物钟乱了，导致感受的时间和真实的时间不一样；最后一个是喜欢睡，睡到自然醒的时间很长，但是被唤醒的的能力不变。
为了验证以上三个原因，研究人员做了换笼子、喂咖啡因等唤醒实验，也检测了嗜睡小鼠的生物钟，发现嗜睡小鼠被唤醒的能力没有减弱，生物钟也正常。因此，突变使得小鼠喜欢睡，睡到自然醒的时间变长最有可能解释小鼠嗜睡的现象。进一步的实验和分析发现，这些小鼠清醒时的脑电波的慢波活动（slow-wave activity）也远多于正常小鼠，表示它们清醒的时候其实也经常犯困。此外，强制它们几个小时不睡觉之后，它们补觉时间远比正常小鼠多。总之，它们真的就是爱睡觉啊，Sleepy（嗜睡）这个名字真的名副其实。
那么，嗜睡对应的基因是什么呢？通过定位，发现嗜睡家系小鼠在一个叫Sik3的激酶基因的一个内含子中的突变，是导致表型的原因。内含子本身并不参与编码蛋白，但是Sik3的这个突变在内含子中剪切体识别的位点，导致Sik3的mRNA剪切错误，少了一段（exon13，即第13个外显子），最终导致Sik3蛋白缺失了一段。为了验证Sik3蛋白缺失了这一段是导致小鼠嗜睡的主要原因，研究者们利用基因编辑的手段在正常小鼠中制造了Sik3基因第13个外显子的缺失，结果发现表型和嗜睡小鼠一样，从而证明了他们的假设。
►Sik3 mRNA在前脑神经元中被广泛表达。来源：Funato H, Miyoshi C, Fujiyama T, et al. Nature . 2016
为什么Sik3缺失了这一小段几十个氨基酸就影响到睡眠呢？研究者们发现，这一段的序列高度保守，也就是从线虫到人，这一段的蛋白序列几乎一样，而且都包含了一个被PKA磷酸化的RRAS位点（其中的丝氨酸S会被PKA磷酸化）。因此，作者们猜测，这个磷酸化位点的缺失可能导致了Sleepy的表型。他们继而在果蝇中，在不改变内源野生型Sik3的情况下，诱导表达磷酸化位点突变为丙氨酸的Sik3（S563A，即无法再被PKA磷酸化），导致果蝇很快变得嗜睡。这不仅证明了PKA磷酸化位点的重要，而且也预示着这个Sik3突变很可能是一个功能获得型突变（gain of function）。一个蛋白突变导致表型有两种可能：一种是突变导致蛋白功能丧失，另一种则是突变使得蛋白与野生型不一样，获得了新的功能。在这个实验里，野生型Sik3并没有被影响，所以表型应该是Sik3_S563A表达的蛋白具有的新的功能引起的。然而，我们也不能排除Sik3_S563A抑制了野生型Sik3的功能从而导致这种表型的可能。
►产生嗜睡基因突变的小鼠（紫色）清醒时间低于携带Sik3野生型基因的小鼠。来源：Funato H, Miyoshi C, Fujiyama T, et al. Nature . 2016
为了进一步验证Sik3突变是否为功能获得型突变，研究者们检测了Sik3功能缺失或敲除的果蝇和线虫，发现它们的睡眠时间变短了，而非变长，与嗜睡小鼠相反。这证明了Sik3功能丧失并不会导致嗜睡的发生，反而会导致睡得少。因此，嗜睡小鼠的突变不是功能丧失型突变，而是是功能获得型突变（这里为什么不做敲除小鼠了呢？也许是Sik3敲除了会致死，也许是日本人也忍不了想赶快投文章了吧……）。
综上，作者们发现的第一个控制睡眠长短（但非做梦长短）的Sik3基因，它表达的蛋白如果不能被PKA磷酸化会导致嗜睡。未来也许可以由此开发PKA的激动剂抑制睡眠，阻断剂用于增长睡眠呢！
“无梦”的基因突变
日本人发现的另一个睡眠基因Nalcn与笔者很有渊源。事实上，Nalcn这个名字是我和我的博士生导师Dejian Ren教授命名的。我和我的导师都是中国人，所以基因名字里有中国的代号CN。实际上，这个名字代表Na leak channel nonselective。我们发现Nalcn表达的离子通道蛋白在神经处于静息状态时，传导了一个很小的背景钠离子漏电流。尽管这个电流很小，但流入的阳离子也足以使得神经元的跨膜电位发生几毫伏的变化，更接近神经元进入兴奋状态的阈值，从而增加其发放动作电位的几率，也就增加了神经的兴奋性。因此，这个基因的缺失，会导致神经兴奋性降低、呼吸等节律行为丧失、小鼠出生24小时内死亡等严重后果。与大多数离子通道不同，Nalcn表达的离子通道的电导不受电压影响，但是会受神经肽和细胞外钙离子浓度等调控，因此可能参与多项生理及病理过程。近年来的研究也发现这个基因的突变的确是导致多种神经兴奋性疾病的原因。
Nalcn在睡眠中起作用，某种程度上可以说是意料之中。睡眠时细胞外钙离子浓度会周期性变化，我曾经猜测Nalcn可能感受此变化由此控制神经的周期性兴奋从而控制睡眠时间。而美国科学家Ravi Allada等人在2015年则根据我已发表的工作及他们的数据提出了Nalcn参与生物钟节律（Circadian）的“自行车”模型（Bicycle model）【5】。白天活跃时，Nalcn结合蛋白NFL-1的活性增强，导致Nalcn蛋白分子到达细胞膜（上膜）的数目增加，从而增加神经兴奋性，动物处于活动期。晚上休息时，NFL-1的活性减弱，导致Nalcn上膜减少，从而降低神经兴奋性，动物进入休息睡眠期。
在日本科学家的这篇文章中，作者们发现了Nalcn的突变引起的一个非常有趣的表型：无梦（dreamless）。无梦的小鼠，清醒和不做梦的睡眠总时间相比正常小鼠只有很轻微的增加，而做梦（即眼快动睡眠，REMS）的总时间则减少了近一半（因为REMS的基数小）。进一步的分析发现，做梦减少的原因是做梦的时间碎片化了，从梦境中醒来变得非常频繁。换句话说，梦境变得非常不稳定（有没有想起《盗梦空间》？）。
进一步的遗传学分析发现，无梦这个突变实际上是Nalcn的一个点突变，导致其Nalcn蛋白的315号氨基酸由天冬酰胺变成了赖氨酸（N315K）。通过电生理的记录发现，突变后的Nalcn通道所介导的电流与野生型电流的性质完全一样，但是电导要大很多。这样的直接结果是神经的兴奋性增加，小鼠也就更容易从梦境中醒来。与之一致，突变小鼠控制做梦的 deep mesencephalic nucleus（DpMe）神经元的兴奋性大大增加，从而可能导致了小鼠梦境的不稳定，做梦也就减少。这很明显也是一个功能获得型突变，因为突变使得Nalcn电导增加，而非减少或丧失。这与我们之前的结果一致：增加Nalcn电导会增加神经兴奋性，最终导致dreamless（无梦）。而这里作者们没有做功能丧失型突变实验的理由就很充分了——我和博士生导师很多年前就发现了，功能丧失了会死啊……
通过正向遗传学的方法和上万只小鼠的脑电图测量，柳泽和同事们找到了影响睡眠时间和做梦时间的两个关键基因，不仅意味着我们对睡眠的认识逐渐到达了分子水平，也意味着我们也许以后能找到控制睡眠长短甚至做梦长短的方法或药物，甚至订制梦境也并非痴人说梦……
这项研究也带来很多新的问题：为什么Sik3的磷酸化能控制睡眠长短？为什么又要通过PKA控制这一点？为什么Nalcn突变影响神经兴奋性却只影响做梦时间？等等。关于最后一个问题，笔者其实有一些想法，欢迎有兴趣的科学家们一起讨论。
最后，最重要的是，当你睡懒觉，而父母喊你早起时，你可以翻出Nature这篇文章告诉他们：睡懒觉是遗传的啦！
►北京大学教授饶毅今年2月参加筑波大学柳沢正史组织的学术会议时纪录其研究，柳沢正史当时公布已经拿到基因，但未公布基因是什么。
感谢丁澦、冯欣然、崔笑添以及饶毅教授的意见。
参考文献
1. Xie, L., et al., Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science, 2013. 342(6156): p. 373-7.
2. Kayser, M.S., Z. Yue, and A. Sehgal, A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science, 2014. 344(6181): p. 269-74.
3. Cirelli, C., et al., Reduced sleep in Drosophila Shaker mutants. Nature, 2005. 434(7037): p. 1087-92.
4. Funato, H., et al., Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature, 2016.
5. Flourakis, M., et al., A Conserved Bicycle Model for Circadian Clock Control of Membrane Excitability. Cell, 2015. 162(4): p. 836-48.
6.Lin L, Faraco J, Li R, Kadotani H, Rogers W, Lin X, Qui X, de Jong P, Nishino S, Mignot E (1999). The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2 gene. Cell 98:365-376.
7.Chemelli RM, Willie JT, Sinton CM, Elmquist JK, Scammell T, Lee C, Richardson JA, Williams SC, Xiong Y, Kisanuki Y, Fitch TE, Nakazato M, Hammer RE, Saper CB, Yanagisawa M (1999). Narcolepsy in orexin knockout mice: molecular genetics of sleep regulation. Cell 98:437-51.
作者简介
鲁伯埙
复旦大学教授，从事神经疾病研究工作。以第一或通讯作者发表多篇研究论文于Nature、Cell、Nature Neuroscience、Neuron、eLife等期刊。
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