小麦未知基因的快速克隆方法7—AgRenSeq技术
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来自于野生近缘材料中的抗病基因（R基因）对作物抗性育种意义重大，多个抗病基因的聚合是选育具有持久抗性品种的有效方法。目前R基因的克隆策略一般都是针对单抗病基因，比如传统图位克隆法、MutReqSeq技术或MutChromSeq技术等，同时也需要较大数量的分离群体或突变群体（创制独立的突变单株）。今天我们分享的这篇文章中，作者为了在较短时间内同时克隆多个抗病基因，开发了AgRenSeq（associationgenetics with R gene enrichment sequencing）技术。该技术结合关联分析和R基因捕捉测序而开发，在不到6个月的时间克隆了4个秆锈病（stem rust, Sr）抗病基因。我们就一块来学习一下这篇发表在预印版杂志bioRxiv上的文章“Resistance gene discovery and cloning by sequence capture andassociation genetics（doi:http://dx.doi.org/10.1101/248146）”。
粗山羊草（Aegilops tauschii）是普通小麦D基因组的供体，含有很多优良秆锈病抗病基因，在普通小麦抗病育种中被广泛利用。作者选择了来自于不同地域的174份粗山羊草strangulata亚种材料和21份tauschii亚种材料进行研究，这些材料中包含已克隆的Sr33和Sr45基因的多份供体材料。利用R基因捕捉测序技术，作者组装出了平均1437个R基因contig（平均299个编码全长R基因，1137个编码部分R基因）。同时作者对这些材料进行了7个不同秆锈病生理小种的抗病性检测，大约有10%到67%的材料对不同生理小种表现出了秆锈菌抗性。基于上面的数据作者以k-mer值为单位进行了分析，根据不同材料的抗病或感病程度，对每一个k-mer序列进行了赋值统计和图形化展示，并将这些k-mer对应到组装的contig上。具体的流程可参见下图：
作者首先以Sr33基因为例验证了AgRenSeq技术的有效性。秆锈菌生理小种RKQQC对大部分已知Sr基因都有致病性，但Sr33基因除外。按照上面的流程对Sr33基因的供体材料BW_01189进行分析后发现，在一个5.6Kb的contig上存在一个峰值，而该contig正好包含Sr33基因（下图C）。在对151份材料分析后，作者又鉴定出来两个高可信的Sr基因：Sr46和SrTA1662（下图D-E）。在此之前，Sr46基因是通过传统的图位克隆方法得到的，其功能通过3个独立EMS突变体后代得到验证，与本文中利用AgRenSeq技术鉴定到的Sr46基因一致；SrTA1662基因也通过一个重组自交系群体进行了定位和验证，该基因编码一个coiled-coil NLR蛋白，在蛋白水平上与Sr33同源性较高。
上面的分析成功鉴定出了Sr33、Sr46和SrTA1662，但并没有鉴定出Sr45。作者分析可能是由于Sr46基因的存在遮盖掉了Sr45基因的表型。通过去除掉64份含有Sr46基因的材料后，作者对剩余材料进行了重新分析并鉴定出了Sr45的候选基因（上图F）。该候选基因与作者通过MutReSeq技术鉴定的Sr45基因一致，转基因结果也证实了该基因的功能。
AgRenSeq技术并不依赖于参考基因组的物理图谱，可以直接鉴定出抗病基因，其不受目标区间交换频率的限制，也不用创制分离群体或鉴定独立的突变个体，可以在一个自然群体中鉴定出多个抗病基因，高效便捷。小编觉得该方法有几个关键点：自然群体的选择、R基因捕捉技术和基于k-mer值的统计分析方法（相应的软件可以在github上查到，https://github.com/steuernb/AgRenSeq）。如果我们的实验涉及到的不是自然群体，比如突变群体，或者研究对象不是R基因，比如产量性状相关的多个QTL或基因，那我们能不能借鉴该方法来加速目标基因的克隆呢
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