CAR-T基因治疗产品生产过程的质量控制
对于CAR-T细胞免疫基因疗法来说，2017年是具有里程碑意义的年份。2017年8月31日，FDA批准首个CAR-T疗法Kymriah上市，诺华为其定价47.5万美元；2017年10月19日，FDA批准第二款CAR-T疗法Yescarta上市，Kite Pharma为其定价37.3万美元。
CAR-T基因疗法不同于传统药物，是一种基于整合了CAR基因的自体T细胞疗法。这意味着CAR-T必须在尽可能短的时间内完成抽血、分离、激活、转染、扩增、制剂、放行、冻干、运输和给药。
诺华、Juno、Kite三巨头的生产工艺略有区别，选用的生产系统也有所差异。
以诺华的生产工艺为例，其细胞疗法生产车间占地17万平方英尺（17000平米）。临床研究期间共生产超过250个批次。
诺华CAR-T生产车间使用的系统包括Dynabeads CD3/CD28细胞治疗系统CTS（赛默飞）、Elutra、Cell Saver® 5 (Haemonetics)和Sepax™ Automated Cell Processing System (Biosafe)等。
Dynabeads CD3/CD28 CTS
此外还要注意，自体T细胞疗法也意味着每个产品都是独立批次，需要完整的放行检测。据相关专家估计，CAR-T细胞的工艺成本约1.5万美元，而分析质控的成本则可能高达5万美元以上。
那么，CAR-T的放行需要做哪些检测呢？根据CAR-T的作用机制和产品特点，其质量控制无外乎以下几个方面：
Potency 效价
Transduction Efficiency 转染效率
Identity 鉴别
T cell subsets T细胞亚群
Safty 安全性
Potency 效价
CAR-T的Potency主要是T细胞的激活程度，由于T细胞的激活涉及一系列的细胞因子以及癌细胞的杀伤，因而真实效价往往难以获得。通常会选取有代表性如IFN-γ的表达来评估T细胞的激活，在临床试验中发现IFN-γ的变异性非常大（下图为Kymriah的数据），很难直接与CAR-T 的安全性和有效性关联。
Transduction Efficiency 转染效率
CAR基因通过慢病毒质粒转染，整合到T细胞基因中。因此转染效率一般通过质粒拷贝数（VCN/cell）和CAR表达水平来评估。
质粒拷贝数通过qPCR检测，得到相对于CAR阳性细胞数或者总细胞数的质粒拷贝数。生产过程中可以通过调整慢病毒质粒数与总细胞数来优化质粒拷贝数细胞数比。
CAR表达水平可以通过流式细胞术检测CAR阳性T细胞百分比来评估。目前CAR阳性T细胞的百分比控制经验有限，Kymriah的CAR阳性T细胞百分比批次差异性较大。尽管CAR阴性T细胞对安全性和有效性的影响不是十分清楚，但一般不将其作为杂质对待，也不认为其产生明显的安全风险。
Identity 鉴别
鉴别要保证病人使用的为来自自身的细胞，Kymriah同时进一步通过qPCR检测VCN、流式细胞术检测CAR表达来鉴别其为表达CAR的自身T细胞。
T cell subsets T细胞亚群
从外周血分离的PBMC，因个体差异其细胞成分差异很大，经过分离、纯化最终都成为百分之百的T细胞。
但T细胞也包含不同亚群，如CD4 T细胞、CD8 T细胞、记忆性T细胞等，这些亚群都有着不同的生物学功能。Kymriah每一批次都会检测T细胞亚群组成，但没有作为放行标准；Juno则控制CD4 T细胞与CD8 T细胞的比例为1:1。T细胞亚群对于安全性和有效性的影响待进一步深入研究。
Safety 安全性
安全性除了常规的内毒素、支原体及无菌外，主要是围绕慢病毒载体的安全性考量。用于转染的慢病毒必须保证高质量，避免存在具有复制能力的病毒（RCL）、低风险的整合profile。
慢病毒载体的检测分析包括：
外观：载体悬液外观应保持一致性；
鉴别：qPCR检测CAR基因；
安全性：避免微生物污染、RCL污染；
纯度：检测载体和杂质量；
定量：p24蛋白分析和病毒RNA检测；
生物活性：目标细胞转染的效率测定。
CAR-T车间一般包括生产单元、储存单元、质控检测单元等，CMO公司还会有技术转移单元。下图即MaSTherCell公司的CAR-T生产车间平面图，整个车间的建筑面积为600㎡。
生产单元主要是T细胞的分离、纯化、激活、扩增、过滤、制剂等。MaSTherCell为一家CMO企业，考虑到生产过程的灵活性，生产部分含有2个完全相同的生产单元。根据约2周/批的生产周期，每个单元每年可生产100-120批次。
QC（质量控制）单元主要是CAR-T的放行检测，包括生化检测、微生物检测、细胞学检测。生化检测实验室主要使用了Applied Biosysytems qPCR仪等设备，用于CAR-T的鉴别和纯度检测。细胞学检测实验室主要使用倒置显微镜、荧光显微镜、层流罩、二氧化碳培养箱、qPCR仪等，进行细胞计数、活率检测、体外效价检测以及可能的杂质分析等。微生物检测实验室负责对环境的监测，主要进行总厌氧菌的计数、酵母和霉菌的检测，赛默飞提供支原体、病毒检测系统及残留DNA、残留蛋白等的检测。
储存单元的面积超过80㎡，主要进行成品的标签、包装、储存等。冷库中还配备一些-80℃冰箱，用于病毒的存放。技术夹层检测环境，符合GMP要求。
CAR-T疗法的突破性进展，带动了CAR-T生产工艺的快速发展，缩短生产周期、降低生产成本成为满足临床需求、降低用药成本的必然选择。在CAR-T的生产成本中，分析质控占到了很大比例，建立成熟、简便、有效的放行检测体系，对于CAR-T的普及有很重要的现实意义。
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参考资料
CTL019审评资料；
manufacturing of CAR T cells， 2016；
Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy(2017)；Autologous CAR-T Cell Manufacturing: Current Standing and Future Directions；
Novartis、Juno、Kite、MaSTherCell官网。
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