突破AAV载体限制！大基因突变遗传病治疗新思路可治疗失明

来源：MLD科研助手

使用腺相关病毒（AAV）载体进行视网膜基因治疗已被证明在许多眼病中是有效的，相关研究也在如火如荼地进行，FDA已经批准了Spark公司的AAV介导的针对先天性黑蒙症的基因疗法上市，张锋创立的基因编辑公司Editas Medicine开发的AAV介导的针对先天性黑蒙症的CRISPR基因疗法也已获FDA批准开展临床试验。

尽管AAV病毒载体是用于视网膜的最有效基因治疗载体，但是AAV病毒载体装载的DNA序列长度不超过5kb，而且这还要包括一些调控元件，因此AAV病毒载体对于一些较大的基因就无能为力了，这也限制了基因疗法在递送大基因上的应用。

近期，意大利Telethon遗传与医学研究所的研究人员发表了一项题为：Intein-mediated protein trans-splicing expands adeno-associated virus transfer capacity in the retina 的研究论文。

该研究使用多个AAV载体递送，通过一种称为断裂内含肽（Split Intein）的遗传元件，使这些AAV递送的DNA片段反式剪接，实现了大基因的全长蛋白重建，从而高效治疗了Stargardt病和先天性黑蒙症10型。

该研究登上了最新一期的 Science Translational Medicine 杂志的封面。

AAV是目前用于视网膜的最有效的基因治疗载体，但是AAV有限的装载能力限制了它在基因治疗中的应用。尽管有些研究表明，使用双AAV载体或三AAV载体，共转染后它们携带的DNA片段自发重组，可以将DNA装载能力提高到9kb或14kb，但是这一方法在视网膜细胞中的效率很低，很难达到理想效果。

断裂内含肽（Split inteins）是存在于古菌、蓝细菌等单细胞生物体中的一种遗传元件，它们在宿主蛋白的末端表达为两个独立的多肽并催化它们反式剪接形成一个较大的蛋白，催化后并不会在最终蛋白产物中产生遗留。

鉴于断裂内含肽的这种拼接能力，研究人员首先在小鼠和猪的视网膜中验证断裂内含肽对绿色荧光蛋白EGFP的拼接效果。

试验结果表明，断裂内含肽成功将两截EGFP蛋白片段拼接成完整的EGFP蛋白，从荧光情况来看，拼接效率很高，跟单个AAV载体表达的EGFP无显著差异。

这些实验结果表明，通过断裂内含肽的剪接作用，可以成功的将多AAV载体递送多肽片段拼接成完整且具有功能的蛋白质。

接下来，研究人员研究了两个常见的严重视网膜遗传病，分别是Stargardt病（STGD1）和Leber先天性黑蒙病10型（LCA10）。这两种视网膜遗传病分别是因为ABCA4基因和CEP290基因突变所致。而且这两个基因均远超AAV载体装载能力。

Stargardt病，是指黄斑萎缩性损害合并视网膜黄色斑点沉着。本病具有两种特殊征候：黄斑椭圆形萎缩区及其周围视网膜的黄色斑点。是一种原发于视网膜色素上皮层的常染色体隐性遗传病，较多发生于近亲婚配的子女患者。

Leber先天性黑蒙10型，是一种常染色体隐性遗传病，由CEP290基因中的双等位基因功能丧失突变引起，通常出现在婴儿早期，患者表现出严重的视锥营养不良，而且视力低下，甚至完全丧失。

研究人员使用了这两种遗传病的小鼠模型，用AAV-GRK1-ABCA4或AAV-GRK1-CEP290 断裂内含肽注射小鼠眼球，注射后4至7周对动物实施安乐死，并通过WB检测来评估视网膜裂解物中的蛋白质表达。在注射AAV-ABCA4断裂内含肽的11只眼中的10只中检测到全长蛋白，注射AAV-CEP290断裂内含肽的10只眼中的5只检测到了全长蛋白。

此外，研究人员使用了来自人工诱导多能干细胞（iPSC）的人视网膜类器官上进行该实验，同样取得了预期效果。

总的来说，该研究创新性地将断裂内含肽介导的蛋白质反式剪接应用于视网膜内的蛋白重建，使用AAV载体结合断裂内含肽的实验表明，在小型动物（小鼠）大型动物（猪）和人视网膜类器官上，均取得了良好的实验效果，成功重建了Stargardt病（STGD1）和Leber先天性黑蒙病10型（LCA10）的完整蛋白，并恢复了这两种动物疾病模型的视网膜表型。

最重要的是，这一研究突破了AAV载体的限制，为大基因突变导致的遗传病的治疗带来了新的治疗方法和巨大希望。

论文链接：

https://stm.sciencemag.org/content/11/492/eaav4523

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