重症联合免疫缺陷病是源自骨髓造血干细胞的T细胞和B细胞等发育异常所致的疾病，包括常染色体隐性遗传与X-性连锁隐性遗传，属于常染色体隐性遗传病的ADA-SCID是第二大类重症联合免疫缺陷疾病（SCID），占SCID的10~20%。由于细胞和体液免疫的严重缺陷，ADA-SCID的典型表现往往发生在患者出生一年内，伴有严重感染和生长发育障碍，由于感染原因，患儿往往在出生1~2年内死亡。由于母体IgG可穿越胎盘屏障给胎儿，患儿总免疫球蛋白水平在出生时可能仅略微降低，而无法通过胎盘屏障的IgM和IgA通常在刚出生患儿体内是缺乏的。然而，一旦来源母体的IgG水平下降，明显的低丙种球蛋白血症就会表现出来。ADA-SCID的临床表现类似于其他类型SCID，持续性腹泻，皮炎和严重感染。检查一般不见浅表淋巴结与扁桃体，胸部X线检查不见胸腺阴影。此外，大约20％的ADA-SCID病例发生在儿童期（延迟）或更晚期（成人发病）。迟发性患者具有显着的免疫缺陷，但临床表现存在异质性。其临床表现通常与自身免疫病症状类似，包括溶血性贫血和免疫性血小板减少症。晚期患者的血清免疫球蛋白水平发生改变，IgG2水平大幅降低或检测不到，IgE水平升高并且通常与湿疹和哮喘相关，很多患者无法产生抗多糖和肺炎球菌抗原的抗体。ADA在全身组织细胞普遍表达意味着缺乏ADA的后果不仅限于免疫系统受累，对神经，听觉，骨骼，肺，肝和肾系统以及认知也会造成影响。表明该疾病应被视为全身性代谢紊乱病。此外，患有ADA-SCID的儿童表现出一系列行为异常，包括注意力不集中，多动，明显攻击性。与人群平均水平相比，ADA-SCID患儿的智商水平较低。由于感染并发症通常在ADA-SCID患儿临床表现中占主导地位，因此可能会干扰或影响全部非免疫系统相关症状的表现及其自然病程。在欧洲，ADA-SCID发病率估计在1：375,000到1：660,000之间（活产）。ADA是组织细胞普遍表达的代谢酶，虽然各组织酶活性水平差异很大，在淋巴组织（尤其是胸腺），大脑和胃肠道中观察到最高水平。ADA是嘌呤补救途径的酶，其催化腺苷和2'-脱氧腺苷不可逆地脱氨基成肌苷和2'-脱氧肌苷。大多数腺苷源自ATP的内源性分解和RNA的降解，或者被广泛表达的核苷转运蛋白外源吸收。与腺苷不同，由DNA降解形成2'-脱氧腺苷主要通过ADA分解代谢。肌苷和2'-脱氧肌苷可进一步不可逆分解代谢成尿酸或进一步用于嘌呤代谢途径。在没有ADA的情况下，ADA催化反应底物（腺苷和2'-脱氧腺苷）在细胞内外的积累，淋巴细胞尤其具有高水平的激酶，其可以连续地将脱氧腺苷磷酸化为核苷酸dAMP，dADP和dATP（统称为dAXP）。dATP是产生导致ADA-SCID患者泛淋巴毒性的主要代谢产物。细胞内2'脱氧腺苷通过脱氧胞苷激酶磷酸化导致脱氧腺苷三磷酸（dATP）的积累，其抑制核糖核苷酸还原酶，阻止正常的DNA合成和修复。此外，2'-脱氧肌苷能够不可逆地抑制酶S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶发挥作用，导致SAH积累，阻止正常胸腺细胞分化所需的S-腺苷甲硫氨酸介导的甲基化过程，导致T淋巴细胞发育障碍。腺苷是一种重要的细胞外信号分子，相关信号通路的破坏可能会干扰正常的免疫反应。ADA基因于1983年得到分离，定位于人类20号染色体的长臂（基因座20q13.11），长32 kb，有12个外显子，由11个内含子隔开。在ADA-SCID患者中发现了大量ADA基因突变（已鉴定出超过70种致病突变），按突变导致的结果分为：（1）单个氨基酸的取代；（2）翻译过早终止;（3）RNA剪接错误;（4）ADA蛋白翻译后修饰的缺陷和（5）插入或删除DNA片段。一些突变导致蛋白质构型的细微变化使得ADA酶不稳定，因此易于快速降解。有的突变发现在控制ADA基因表达的调控区，影响其基因正常表达。在ADA患者中更常见一些特定的突变，其中一些与某些种族群体有关。同种异体骨髓移植一直被认为是ADA-SCID治疗的主要手段。然而，与其他形式SCID不同，ADA-SCID还有两种其他治疗选择：聚乙二醇结合的牛ADA（PEG-ADA）酶替代疗法和基因治疗。ADA-SCID的免疫系统重建可以通过骨髓移植，酶替代或基因治疗来实现，但是免疫功能的恢复会随治疗手段和个体而变化。当前治疗首选的手段仍然是来自HLA相同供体的骨髓移植，而骨髓移植与高发病率和死亡率相关。使用聚乙二醇结合的牛ADA酶替代疗法则是需要每周肌内注射PEG-ADA的非治愈性治疗。ADA-SCID基因治疗一直是遗传病基因治疗方面的范例。通过上述治疗可以实现不同程度的免疫系统重建，但在治疗后需要密切关注ADA-SCID患者自身免疫症状的发生，报道的自身免疫表现包括：自身免疫性甲状腺功能减退症，糖尿病，血小板减少症，溶血性贫血和抗ADA抗体的产生。造血干细胞移植（BMT）是ADA-SCID和其他严重的原发性免疫缺陷患者的首选治疗策略。由于不到20％的ADA-SCID患者可以找到并接受与本人有血缘关系的完全相合HLA骨髓干细胞供者，因此移植通常来自HLA完全匹配的非血缘关系供者或HLA半相合供者。最近对ADA-SCID骨髓移植结果的回顾性分析，收集了几项多中心研究数据，并分析了接受骨髓移植的106例患者的生存率。发现骨髓来自HLA完全匹配的兄弟姐妹和或其他亲属捐赠者的总体存活率（86％和81％）高于骨髓来自HLA完全匹配的非亲缘关系（66％）和半相合的BMT捐助者（43％）。长期观察免疫恢复显示，无论移植类型如何，总体T细胞数量相似，尽管在HLA匹配的同胞或匹配的无亲缘关系骨髓移植后观察到更快的T细胞恢复速率。在几乎所有可评估的存活患者中实现了体液免疫和供体B细胞植入，并且大多数患者能够停止免疫球蛋白替代治疗，表明免疫恢复相对完整。根据现有数据，一些患者即使在骨髓移植10年或更长时间后，其免疫和代谢恢复也能很好地维持。然而，在很大一部分存活患者中观察到由于骨髓早期植入不良或免疫功能逐渐下降导致的延迟或次优免疫重建，造成诸如移植物抗宿主病，自身免疫和炎症等并发症。总之，从HLA相同的同胞或家庭供体移植获得的结果表明在患者存活和长期免疫恢复方面良好，HLA半相合的供体移植成功的可能性较小，因此只有在没有其他治疗选择的情况下才能进行。牛ADA通过赖氨酸残基连接PEG成为PEG修饰后的ADA，这种化学修饰降低了其免疫原性并防止其被血浆蛋白酶降解以及被中和抗体结合。这样使得牛ADA的循环寿命从几分钟延长到几天。细胞摄取的PEG-ADA是很少量的，其大部分布仅限于血浆。外源性PEG-ADA给药的原理基于血浆中积累的ADA底物被PEG-ADA直接转化清除和PEG-ADA通过扩散间接还原细胞内毒性代谢物。PEG-ADA通常通过肌肉注射每周或每两周施用一次。PEG-ADA给药可能会引起副作用，例如自身免疫（I型糖尿病，甲状腺机能减退，免疫性血小板减少症，溶血性贫血）和过敏。此外，PEG-ADA长期给药的一个问题是出现严重的并发症，包括淋巴和肝脏恶性肿瘤以及慢性肺功能不全。PEG-ADA产生的主要副作用是抗ADA抗体的产生，酶替代疗法中约10%的患者会产生抗ADA抗体，导致PEG-ADA的清除，随后PEG-ADA疗效降低。总之，酶替代疗法不是治愈性手段，需接受长期治疗，治疗不仅成本高，有明显副作用，且疗效会逐渐降低。ADA-SCID 疾病的体外基因治疗常用的是γ-逆转录病毒与慢病毒，进行了大量临床试验，且有相关药物Strimvelis获批上市。ADA-SCID很适合用基因治疗手段治疗的依据在于：（1）ADA基因是一种普遍表达的管家基因，不需要精细调节，因此过表达可用病毒启动子，此外，ADA cDNA较短（1.5kb）,可以很容易地克隆并由病毒载体表达。（2）相对低的酶水平就可使携带正常ADA基因的健康个体具有正常的免疫功能。（3）基因校正的细胞比ADA缺陷细胞有较强的选择性存活优势，因为基因校正细胞可以更容易地从细胞内消除毒性代谢物， 因此，为了避免损害基因校正细胞的选择优势，在基因治疗前停止酶替代疗法很重要。相比目前的其他ADA-SCID疗法，基因治疗的优势在于：（1）由于所用的是自体造血干细胞，因此不会出现移植排斥等不良反应，不会因寻找HLA配型供者而耽误治疗时间。不过此疗法的风险在于，可能会导致患者发生癌症，虽然目前在ADA-SCID 体外基因疗法实验中未见此事故的发生，但在一些接受γ-逆转录病毒体外基因治疗的X-SCID、 Wiskott-Aldrich综合征（WAS）和慢性肉芽肿病（CGD）临床试验中出现了上述致癌事故。提示针对不同疾病，逆转录病毒体外基因疗法致癌几率是不同的，众多例ADA-SCID 体外基因疗法临床试验未见癌变临床事故，表明ADA-SCID 体外基因疗法相对有更高的安全性。此外，因γ-逆转录病毒与慢病毒整合位点的偏好性差异，慢病毒的整合较少引起细胞的癌变，整体上比γ-逆转录病毒更为安全。身体的各种组织可能具有对ADA的依赖性不同，可能是组织对ADA的依赖性越大，在没有ADA的情况下毒性代谢物在此组织的积累就越多，并且对该组织越具破坏性。例如，在身体组织中，B淋巴和T淋巴细胞严重依赖于ADA活性。当ADA合成受阻和功能受损时，该疾病最明显的特征是免疫系统功能障碍。因此在治疗策略上，应该首先解决疾病的最严重方面，即免疫系统。此外，任何潜在的ADA-SCID治愈方法都应该旨在直接或间接靶向身体的许多组织，包括神经、肌肉骨骼系统等。rAAV与逆转录不同，逆转录病毒携带的目的基因整合进靶细胞基因组后可随着血细胞的分裂或分化获得广泛的扩散传递，rAAV整合的频率低得多，并且通常在宿主细胞中以附加体形式存在。因此，在诸如HSC中，尽管已经证明了一些整合rAAV7，大多数附加型rAAV可能在靶细胞几轮分裂或分化后丢失。一种解决方案是靶向除造血干细胞以外的组织，这些组织大部分细胞不分裂或分裂缓慢，例如骨骼肌，肝脏甚至脑，这样也许可以长时间维持rAAV附加体的丰度并可向外分泌hADA。一方面，局部hADA表达可以使目的基因载体存在的组织解毒，例如骨骼肌，肝脏或脑，改善局部组织恶化；另一方面，分泌的hADA可以系统地发挥其作用，用于全身解毒，引起循环腺苷、脱氧腺苷和dATP的水解脱氨。未见AAV治疗ADA-SCID的临床试验报道，只见AAV治疗ADA-SCID模型小鼠相关报道，研究人员在ADA-SCID小鼠模型上证明了AAV治疗ADA-SCID有一定效果。由于小鼠的ADA完全缺乏会导致胚胎致死，通过转导ADA基因，使其在胎盘中表达，可避免胚胎致死（doi:10.1074/jbc.273.9.5093）。a:一种是转导的ADA基因在小鼠胎盘中表达。此模型小鼠通常出生后仅存活3周，死于肺功能不全和重度肺嗜酸性粒细胞增多。b:一种是转导的ADA基因在胎盘（出生前转导）和前胃（出生后转导）中表达。该模型小鼠显示部分免疫缺陷，一般寿命接近正常（doi: 10.1007/s10875-017-0433-3）。寿命长的这种小鼠模型的B，CD3 +，CD4 +和CD8 +细胞亚群有缺陷，对于NK细胞，未观察到明显缺陷（doi: 10.1089/hum.2010.121），见下图：
鉴于单链AAV注射后目的基因表达时间可能需要1~2周，若肌肉等局部注射，目的蛋白还需要分泌系统性发挥疗效，再加上免疫重建所需的时间，也许寿命长的小鼠模型更合适常规注射治疗，但由于是部分免疫缺陷模型，所以在评估药物疗效上也许有一定限制。
当然，自身互补AAV可以快速表达目的基因且载体基因组更稳定（ADA表达载体的分泌信号加目的蛋白基因总长约1.2kb），因此蛋白表达量可以快速提升，用于寿命短的模型要优于单链AAV。当然，单链AAV可通过胚胎期注射或小鼠出生后，早期以更高的注射剂量注射也许可以使得目的蛋白的表达量在小鼠出生后早期达到合适治疗剂量，延长寿命短小鼠寿命。体外慢病毒基因治疗用的小鼠模型一般为寿命短的。一项研究在小鼠2周龄时，注射慢病毒转导的细胞，模型对照组小鼠3周内全部死亡，实验组小鼠六个月时存活率与野生对照组无显著差别。（doi: 10.1182/blood-2006-05-023507）Jared N. Silver选用的为寿命长的小鼠模型（doi 10.1089hum.2010.121），其载体图谱如下：
① AAV1肌肉内注射：检测注射后第9、30和45天血清ADA活性，给药组与模型对照组无明显差异。
② AAV9静脉注射：检测注射后第9、30和45天血清ADA活性，给药组与模型对照组虽无统计学差异，但是给药组的ADA活性平均值高于模型对照组，其结果比AAV1肌肉注射效果略好。
① AAV1肌肉内注射免疫重建：未见明显的免疫重建结果。
② AAV9静脉注射免疫重建：与模型对照组相比，给药组小鼠淋巴细胞总量及其亚群有较为明显得上升趋势。
参考资料：
1.Biological Advances, Clinical Outcomes and Strategies for Capitalisation 2020, 2.Pages 15-39.doi: 10.1016/B978-0-12-812034-7.00002-9
3.Orphanet J Rare Dis. 2018 Apr 24;13(1):65. doi: 10.1186/s13023-018-0807-5.
4.Hum Gene Ther. 2017 Nov;28(11):972-981. doi: 10.1089/hum.2017.175.
5.J Clin Immunol. 2017 Oct;37(7):626-637. doi: 10.1007/s10875-017-0433-3
6.Front Immunol. 2012 Aug 27;3:265. doi: 10.3389/fimmu.2012.00265.
7.Hum Gene Ther. 2011 Aug;22(8):935-49. doi: 10.1089/hum.2010.121.
8.Pharmacogenomics. 2008 Jul;9(7):947-68. doi: 10.2217/14622416.9.7.947.