肾上腺脑白质营养不良（X-ALD）基因治疗概述
一、疾病背景
1、临床症状及分型
X连锁肾上腺脑白质营养不良症（X-ALD）是X连锁隐性遗传病，是一种最常见的过氧化物酶体病，主要累及肾上腺和脑白质，半数以上的病人于儿童或青少年期起病，主要表现为进行性的精神运动障碍，视力及听力下降和（或）肾上腺皮质功能低下等。
根据ALD的发病年龄及临床表现分为7型：儿童脑型、青少年脑型、成人脑型、肾上腺脊髓神经病型(Adrenomyeloneuropathy，AMN)、Addison 型、无症状型和杂合子型，其中占比最高的是儿童脑型和AMN型。
儿童脑型：最为常见，约占所有ALD病人的35%，多于5-12岁发病，初期表现为注意力不集中、记忆力减退、学习困难、步态不稳、行为异常等，逐渐出现视力和（或）听力下降、构音障碍、共济失调、瘫痪、癫痫发作、痴呆等症状，逐步进展，最终完全瘫痪，失明或耳聋，可有惊厥，甚至出现惊厥持续状态。有的可维持去大脑强直状态数年，有的出现中枢性呼吸衰竭、脑疝、感染等而死亡。多数在首次出现神经系统症状时已有肾上腺皮质功能受损。
青少年脑型：青春期脑型10-21岁起病，临床表现类似于儿童脑型，但进展缓慢。约占所有ALD病人的4-7%。
成人脑型：于21岁以后起病，脑内迅速进展，炎症反应性脱髓鞘类似儿童脑型，无AMN表现。约占所有ALD病人的2-4%
AMN型：常于20-40岁发病，病损主要累及脊髓自质，周围神经受累较轻，不伴炎症性损伤。表现为进行性的下肢痉挛性瘫痪、括约肌和性功能障碍等，瘫痪进展缓慢，可伴有周围神经损害，有肾上腺皮质功能不全表现，并可见原发性性腺发育不全伴睾酮减低，可继发脑部损害而出现不同程度的认知和行为异常，AMN进展较慢，无多发性硬化的缓解和复发的特点，约占ALD的27%。
Addison型：发病年龄在2岁至成年期间，表现为原发肾上腺皮质功能不全，临床可见皮肤发黑，嗜盐，多汗，疲乏无力，经常呕吐、腹泻、晕厥等。约占ALD病人的10-14%。
无症状型：是指通过检查发现血VLCFA升高或ABCD1基因突变而没有临床症状的患者。
杂合子型：女性杂合子中约20%～30%可有轻微的神经系统症状，多表现为类似AMN的痉挛性截瘫，但症状较轻，很少出现脑部症状、周围神经病及肾上腺皮质功能减退。
2、发病率
1/17000的新生儿带有突变，发病率约为0.5/10万～1/10万。
3、致病机制
由于ABCDl基因突变，导致ALDP功能异常，使得VLCFA的β-氧化受阻，引起VLCFA聚集。VLCFA在神经系统中聚集可破坏髓鞘的正常形成和髓鞘的稳定性，在肾上腺皮质细胞中聚集可引起肾上腺皮质细胞膜表面的ACTH受体功能下降，细胞内类固醇合成受抑制，而致肾上腺功能减退。
4、突变基因及功能
突变基因为ABCD1，位于Xq28，CDS全长2238bp，其基因图谱如下：
ABCD1编码的肾上腺脑白质营养不良蛋白(adrenoleukodystrophy protein，ALDP)位于过氧化物酶体膜上，为非分泌型跨膜蛋白，能将饱和的VLCFA转运至过氧化物酶体内进行β-氧化，蛋白跨膜示意图如下：
X-ALD 数据库（http://www.x-ald.nl）数据显示X-ALD患者ABCD1基因突变类型及其比例为：错义突变（61%），移码突变（22%），无义突变（10%），氨基酸的插入或缺失（4%），外显子丢失（3%）。
二、基因治疗研发现状
X-ALD目前尚无特效的治疗方法，常规药物治疗效果不明显，骨髓移植可以纠正VLCFA的代谢紊乱、重建酶的活性，改善临床症状，以早期治疗效果更好。但研究表明疾病早期经异体造血干细胞移植治疗的ALD患者仍可进展为AMN型ALD（J Inherit Metab Dis. 2015 Mar;38(2):359-61），表明了造血干细胞移植在治疗ALD疗效上的局限性。另外，骨髓移植的困难在于患者骨髓配型供体的获得和免疫排斥反应，因此基因治疗是最有前途的治疗手段。
1、慢病毒体外基因治疗X-ALD
SCID 疾病的体外基因治疗常用的是γ-逆转录病毒，经过了一些临床试验，且有相关药物获批上市，但是γ-逆转录病毒不适用于ALD的干细胞基因治疗，原因在于治疗SCID的目的基因进入目的细胞后，可导致目的细胞的优先增殖，使得基因修饰细胞占据优势。但是治疗ALD的目的基因ABCD1不会导致基因修饰干细胞的优势增殖，因此就目的基因转到效率来看，选用既可以感染非分裂细胞又可以感染分裂细胞的慢病毒要明显优于只能感染分裂细胞的γ-逆转录病毒。此外，因两类逆转录病毒整合位点的偏好性差异，慢病毒的整合较少引起细胞的癌变，整体上比γ-逆转录病毒更为安全（Hum Gene Ther. 2017 Nov;28(11):972-981）。
2001年报道，研究人员用慢病毒载体体外转染小鼠骨髓细胞，之后静脉回注给小鼠，结果小鼠脑中出现了基因修饰的小胶质细胞（骨髓可以分化为小胶质细胞），且可以特异性迁移至神经损伤部位，参与神经的损伤修复。在小鼠模型上证明了慢病毒改造的造血干细胞可以穿过血脑屏障进入神经系统，参与神经损伤的修复。（Nat Med. 2001 Dec;7(12):1356-61）
2004年报道，研究人员用慢病毒载体体外转染人的CD34+，之后静脉注射入小鼠体内，在小鼠神经系统检测到了基因修饰后的小胶质细胞。表明人的造血干细胞经慢病毒修饰后也成功分化为小胶质细胞穿过血脑屏障。（Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 9;101(10):3557-62）
目前国外进行的基因治疗X-ALD临床试验主要是美国蓝鸟公司（BlueBird Bio）推动的慢病毒体外基因治疗。疗法大致流程为：从患者体内取出自体造血干细胞，体外经搭载人ABCD1基因的慢病毒转导修饰后，回输给患者。
其中，蓝鸟公司推进的1/2期慢病毒体外基因治疗X-ALD临床试验（Science. 2009 Nov 6;326(5954):818-23），所用慢病毒载体名称为CG1711,其载体质粒图谱如下：
取得了良好的临床结果，与未受治疗对照相比，接受此疗法的4位患者疾病进展明显减缓，如下：
另外，蓝鸟公司推进的2/3期慢病毒体外基因治疗临床试验所用载体与CG1711类似，为pLBP100，其载体质粒图谱如下：
此临床试验所招募的患者信息如下：
慢病毒体外基因治疗，可明显减缓疾病进程，以早期治疗效果更好；晚期治疗效果较差，不能明显缓解疾病症状及疾病进程，从美国蓝鸟公司推进的2/3期临床试验招募的患者来看，他们都处于疾病早期，神经功能表现正常。
美国蓝鸟公司在2020年第46届欧洲血液和骨髓移植学会年会上发布肾上腺脑白质营养不良基因疗法Lenti-D最新临床试验数据，显示了此疗法的有效性与安全性。公司的首席医学事务官在大会上表示：“在Lenti-D 2/3期临床试验中，87%的患者在接受治疗后的两年甚至更长的时间内病情稳定，未出现重大功能障碍（MFD），同时没有任何一位患者出现移植失败、移植排斥、移植物抗宿主病的现象。包括10名男童患者在内的五年长期随访中，Lenti-D被证实疗效持久且稳定。”（www.wraltechwire.com/2020/09/01）
2020年10月2日，美国蓝鸟公司宣布欧洲药品管理局（EMA）已经正式受理其基因疗法elivaldogene autotemcel ( Lenti-D™，Eli-cel)用于治疗脑型肾上腺脑白质营养不良（CALD）的上市申请，美国蓝鸟公司计划2021年中向FDA提交Lenti-D的上市申请。（adrenoleukodystrophynews.com）
鉴于Lenti-D也是早期治疗效果更好，CALD的早期诊断很重要，因为在现有治疗条件下，患者的临床结局都取决于疾病发展的临床阶段。新生儿的ALD筛查是早期诊断以及成功治疗的关键因素。一旦新生儿被诊断患有ALD，定期进行MRI扫描以指示白质变化对于判断是否进展为CALD至关重要。
在美国，新生儿ALD筛查已经于2016年2月被列为推荐的通用筛查，目前在17个州和华盛顿特区均可进行，覆盖美国58％的新生儿。在美国境外，荷兰卫生已批准将ALD纳入其新生儿筛查计划。尽管大多数欧盟国家尚未实施ALD新生儿筛查，但是在这方面也在努力尝试推进。（m.medsci.cn）
在clinicaltrials官网检索显示，国内一家基因治疗机构在招募X-ALD患者进行慢病毒体内基因疗法，脑内多位点注射带有ABCD1基因的慢病毒TYF-ABCD1载体，目前尚未此疗法进行临床试验的报道。
2、AAV体内基因治疗X-ALD
单纯的造血干细胞移植还是慢病毒体外基因治疗，都是将能够表达正常ALDP的造血干细胞输注给患者，最终一部分携带正常ALDP的造血干细胞分化穿越血脑屏障成为中枢神经系统的胶质细胞，这部分胶质细胞对延缓及阻止中枢神经系统脱髓鞘起到了主要作用。鉴于上述基于造血干细胞的疗法对完全阻止患者神经系统损伤方面的局限性及操作周期较长，可考虑联合使用或单独使用体内基因疗法，即直接将治疗载体注入神经系统。
AAV体内基因治疗可直接将载有治疗基因AAV注入中枢神经系统，使治疗基因或ALDP蛋白以最快速度在中枢神经系统胶质细胞内表达，改善中枢神经系统脱髓鞘症状。
Gong et al.用AAV9-CAG-ABCD1经脑内注射（ICV）和静脉注射(IV)ALD小鼠，结果显示两种注射方式都能够使得ABCD1基因在ALD小鼠脑、脊髓和肝脏等组织器官中表达，且使ALD小鼠体内VLCFA含量降低（Mol Ther. 2015 May;23(5):824-834）。
小鼠后肢蜷缩试验显示无论早期（小鼠5月龄）还是晚期（小鼠13月龄）接受AAV脑内注射治疗，都可以明显减缓AMN病症。
下图是小鼠后肢蜷缩试验示意图及其评分标准。
所用AAV表达载体质粒图谱如下：
上述脑室注射无法很好的使药物分布于整个脊髓（AMN病损主要累及脊髓自质），鞘内注射方式进行系统性给药可以很好使药物弥散在脑脊液中，通过脑脊液循环，重力扩散作用使药物很好的分布于神经系统（脑、脊髓），但鞘内注射给药易使药物发生系统渗漏（systemic leakage）对中枢神经系统以外的组织造成损伤。Gong et al（Human Gene TherapyVol. 30, No. 5）用小鼠模型研究发现，相比直接鞘内注射给药AAV9，经渗透压泵辅助鞘内给药明显减少了AAV9进入外周器官，尤其是心脏和肝脏。
Roberto Mastroeni et al.将带有神经营养因子（hNT3和hIGF1）的载体AAV6-PGK1 -hNT3和AAV6-PGK1 -hIGF1注入ALD小鼠脑脊髓液中，诱导了髓鞘的生成和胶质细胞的存活，有效抑制了中枢神经脱髓鞘（Ann Neurol. 2009 Jul;66(1):117-22）。因此，AAV载体除了搭载ABCD1基因外，可考虑搭载其他可以促进神经修复或胶质细胞再生的目的基因，以增强疗效。
3、X-ALD动物模型
X-ALD动物模型首次报道于1997年，三个不同的实验室先后于Biochem Biophys Res Commun.、PNAS和J Neurosci Res.上发表，他们通过基因打靶技术分别构建了ABCD1基因第1外显子缺失、第2外显子缺失和第1外显子缺失的ALD小鼠模型，这些ALD小鼠模型表现为体内多组织VLCFA水平显著升高，但ALD小鼠直到六月龄，未出现神经受累症状。（Biochem Biophys Res Commun. 1997 Mar 27;232(3):631-6；Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Aug 19;94(17):9366-71；J Neurosci Res. 1997 Dec 1;50(5):829-43）
综上所述，即使完全缺失ALDP的ALD小鼠模型，直到6月龄仍未出现任何神经受累症状，与人ALD患者神经症状表现上存在很大差别，此模型在评价药物对CALD（脑型ALD）相关症状改善方面存在一定限制，至今还未见报道符合CALD患者临床病症的小鼠模型。
2002年发表于Hum Mol Genet. 的研究结果显示ALD小鼠在15月龄左右开始出现神经及行为方面的病症，类似于AMN型ALD患者疾病进展及临床病症。因此此模型适合用于AMN型ALD 药物的研究。（Hum Mol Genet. 2002 Mar 1;11(5):499-505）
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