提高AAV对T细胞及造血干细胞转导效率研究新进展
撰文｜张晓敏
AAV载体在多种疾病治疗上极具前景，但AAV对一些类型细胞或组织器官的转导率低，限制了其更为广泛的临床应用。有报道称过高剂量给药AAV会明显增加严重临床副作用的风险，因此，从安全角度考虑有必要提高AAV的转导率，降低给药剂量。另一方面，较低的病毒使用剂量，可以降低生产难度，降低成本，因此，从临床的广泛应用及商业化角度考虑，有必要提高AAV的转导率。
另外，目前针对T细胞或造血干细胞的体外基因治疗大多采用慢病毒或逆转录病毒，慢病毒或逆转录病毒随机整合会带来的潜在风险，而定点整合技术可以缓解这一难题，当然就目前来看，需要提高定点整合的效率。应用CRSPR基因编辑技术联合AAV-Donor载体可明显提高目的基因的定点整合率，但AAV对T细胞及造血干细胞相对较低的转导率是其临床应用受到限制的因素之一。因此，很有必要提高AAV对T细胞或造血干细胞的转导率。
提高AAV转导效率的方法之一是针对衣壳VP蛋白的突变，AAV 衣壳主要由VP1、VP2、VP3组成，（以AAV2为例，见下图）相对VP2序列，VP1多出的N端序列（1-137aa）称为VP1u（u 是unique的意思），与VP1编码序列重叠的有一段相对VP1 ORF移码后的ORF可编码AAP（装配激活蛋白，assembly-activating protein）,AAP 蛋白分子量为23kD，AAP主要定位于细胞核内，能帮助VPs进入细胞核，并可能为VPs装配提供支架或协助VPs进行正确折叠，没有AAP情况下，AAV VPs不能有效组装成病毒颗粒。
下图是VP蛋白三维结构图，VP1u及VP1/2位于衣壳内部。研究表明在没有VP1时，VP2和VP3也可以包装成成熟的含基因组的AAV颗粒，但此病毒感染性相对较低，提示VP1在病毒粒子的稳定性或感染性上的重要性。
有文章报道：VP2在病毒样空颗粒装配中发挥重要作用，VP3需要在VP1或VP2 协助下完成核定位，VP3对于AAV的组装是必须的，VP1 N端的一些基序在AAV感染过程中发挥关键作用。
为此，研究人员通过合理设计，将AAV6的VP1u和VP1/2区域序列替换为其他血清型AAV的对应区域，创建嵌合的AAV6衣壳突变体。研发出了对T细胞转导率明显增强的AAV衣壳突变体。并且此类突变体，对其它组织细胞类型（例如造血干细胞和神经细胞）也具有相对明显高的转导率。并且，对这些衣壳突变体序列实验分析表明，编码VP2 Cap蛋白ORF和组装激活蛋白(AAP) ORF的重叠区域对于病毒产率和转导率都至关重要。相关研究成果以“Adeno-associated Virus (AAV) Capsid Chimeras with Enhanced Infectivity Reveal a Core Element in the AAV Genome Critical for both Cell Transduction and Capsid Assembly”为题，发表在病毒学领域顶刊杂志JVI上。
首先研究人员设计出了下图所示的7个衣壳突变体，突变区域位于AAV6 衣壳的VP1u与VP1/2区。
上述突变是“理性设计”产生的。首先，研究人员将AAV1到AAV13，且包括AAVrh.10在内的不同血清型的VP1u与VP1/VP2公共区域氨基酸序列进行比对，然后选取了其中相似度相对较低的AAV4、AAV5、AAV11、AAV12的VP1VP2区域作为后续衣壳突变体构建的片段序列来源。虽然选取的这几个血清型VP1VP2之间序列相似度相对低，但它们和AAV6 VP1VP2之间的多序列比对显示了功能区域具有一定的保守性，其中保守区域包括PLA2基序、钙结合基序和作为核定位序列(NLS)的一些保守序列，当然在下游的末端保守区域来看，AAV5与其它几个血清型有差异。比对结果显示VP1u区域比VP1/2区域具有更高的序列一致性。（见下图）
根据上述的序列比对结果，研究人员选取AAV4、5、11、12血清型AAV的VP1u或VP1/2区域替换AAV6的对应的序列区域，构建了这7个衣壳嵌合的突变体。（见下图）
为了评估AAV6 衣壳突变体的转导效率和递送的目的基因的整合效率，首先将cas9 mRNA与靶向AAVS1位点sgRNA 通过电转导入T细胞，之后以不同的MOI感染AAV6的衣壳突变体。AAV6衣壳突变体递送的目的基因为两侧含有同源臂的nanoluc 表达盒，通过同源重组将nanoluc表达框整合到AAVS1位点。感染后第7天和14天测Luc，评价AAV转导效率和基因组整合效率，与未突变AAV6相比，突变体2、4、5的转导率和基因组整合效率明显优于未突变的AAV6载体及其他变异体。（见下图）
突变体2、4、5分别为AAV4、AAV11、AAV12的VP1/VP2区域替换了AAV6的VP1/VP2区域。仅包含AAV11和AAV12的VP1u区域的突变体没有显示出转导率和基因组整合率的提高，这表明它们的VP1/2共同区域是提高转导率的决定因素。含AAV5与AAV6 VP2的AAV 衣壳突变体AAV转导效率差。我们看一下AAV5，AAV6血清型与其他几个血清型在VP1/2 序列差异，与AAV4，11，12相比，AAV5与AAV6的VP1/2 缺少一个核定位基序。（见下图）
研究人员进一步分析了上述有效的三个衣壳突变体AAV在人CD8+T细胞和CD34+造血干细胞中的转导率，图A表示，MOI为1E4，MOI比较低，且在cas9靶向AAVS1位点介导细胞基因组双链断裂的情况下，三个突变体转导效率明显提升。图B表示 在没有CRISPR介导的双链断裂的情况下，也观察到了AAV突变体5的这种增强转导的现象，B图只做了突变体5，由于没有Crispr介导的双链断裂，AAV转导的Luc基因整合的相对少，所以随着T细胞或造血干细胞的分裂，luc阳性细胞会被明显稀释。转导率高对临床应用是一大亮点，但是如果病毒的产率太低，也不利于临床化广泛应用。
因此，需要考虑这些高转导率突变体的病毒产率，将衣壳突变体对T细胞转导能力与其病毒产率进行比较，发现针对T细胞转导率最优的三个突变体的病毒产率比未突变AAV6的产量低成百上千倍，其它转导率低的突变体产率未受明显影响。这一结果表明，突变体2、4、5中的衣壳序列片段的替换影响了其衣壳组装或影响衣壳组装后病毒颗粒的稳定性。（见下图）
起初，研究人员试图通过优化AAV载体转染包装参数提高产量，例如：改变转染试剂、改变AAV helper质粒和AAV 包装质粒的转染比例、或延长细胞转染时间，想以此提高突变体5的产量，最终这些措施未能有效提高其产率（见下图）。为此，研究人员着手改造衣壳序列。
鉴于AAP对AAV衣壳组装的重要性，研究人员分析了AAP在每个衣壳突变体开放阅读框（ORF）序列变化。7个衣壳突变体中，4个突变体的AAP序列相对于野生型AAV6发生了变化，包括转导效率明显增强的那三个突变体2，4，5。早期的文献也报道了AAP N末端在衣壳稳定性和组装中的重要性。因此，推测突变体2，4，5的AAP功能受损影响了病毒的产率。为了恢复突变体5 丢失的AAP功能，针对突变体5的AAP翻译区设计了一系列突变体，一种是将突变体5的AAP序列回复突变为AAV6的AAP，此新的突变体命名为AAV Variant 5.1，5.2到5.6 对其它不同区域进行突变。（见下图）
AAV Variant 5.1，病毒产量达到野生型AAV6的水平。这一结果也就在一定程度上说明了是因为AAP功能受损导致AAV衣壳突变体5的产量急剧下降。但是其针对T细胞的高转导率消失了，回复到了AAV6的水平。那么这一小段AAP突变序列中，对于AAP的功能，哪些残基发挥了最为重要，最为核心的功能，如何突变既能够提高对T细胞转导率，又能维持高产率。研究人员对残基进行了部分回复突变，针对AAV衣壳突变体5的后续这些部分回复突变，只有21-27位的疏水残基的回复突变使其病毒产量有一定程度的提升，提升约1个数量级。为了进一步证明AAP功能受损是影响病毒产量的原因。研究人员设计实验通过反式提供AAP来明显提高病毒产量。通过共转染AAP的过表达质粒，其病毒产率明显提升。若AAP过表达质粒采用的起始密码子为AAP自然状态下的CTG，则不会提高病毒产量，若AAP过表达质粒采用的起始密码子为ATG，则能够显著提升其病毒产量。表明反式提供AAP，需要强启动信号来启动AAP的表达，才能显著提高病毒产率。
回复突变体，产率有所提升，但对T细胞转导率是否有影响，通过测定luc，测定不同突变体对T细胞的转导率，发现虽然将AAP完全回复突变的突变体5.1的产率得到完全的回复，与AAV6产率相当，但其对T细胞的高转导率完全丧失，其对T细胞的转导率回复到突变前水平与AAV6相当。AAP不完全回复突变的突变体5.3，虽然其产率得到显著提升，但针对T细胞的转导率有所下降，相对突变体5的转导率下降1个数量级，但高于突变体5.1一个数量级，介于突变体5和突变体5.1之间。
通过共转染过表达AAP质粒，反式提供AAP使得突变体病毒产率有所提升，但这种方法产出的病毒对T细胞转到率是否有影响，通过测定luc，检测其对T细胞的转导率，结果表明，当过表达质粒起始密码子为ATG的时候，产生的病毒转导率略高于过表达质粒起始密码子为CTG的时候。表明过表达质粒起始密码子为ATG的情况下反式提供AAP，提高产率的方法，不会明显影响其对T细胞的转导率。（见下图）
研究人员通过WB在蛋白水平上进一步验证AAP是AAV突变体包装生产所必须的，当没有反式作用提供AAP情况下，相对AAV6，AAV突变体衣壳蛋白VP产量极低，这肯定会严重影响AAV突变体的包装及产率，当反式作用提供AAP情况下，其VP产量明显提高。B图是纯化后的AAV6与其突变体的SDS-PAGE，显示突变体与AAV6一样，其衣壳蛋白VP1、VP2、VP3比例为1：1:10。（见下图）
鉴于AAV6衣壳突变体对T细胞及造血干细胞的高转导率，研究人员测试了突变体对其它细胞系的转导率。发现相对于AAV6，AAV12及衣壳突变体5，衣壳突变体5.3对神经细胞系（例如Neuro2A、U87和HMC3）有明显高的转导率。（见下图）
综上所述，（1）上述AAV衣壳变体增强了对特定细胞的转导率，降低了AAV的给药剂量，提高了AAV载体临床化应用的潜力。（2）因为在VP 蛋白编码基因上存在其他功能蛋白的移码阅读框，所以在对AAV衣壳进行突变促进其转导率或提高其安全性时，对是否引起其它功能性蛋白（例如AAP或MAAP）的突变需引起注意。
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