西湖大学常兴课题组首次报道TAM碱基编辑器高效治疗DMD疾病

10月26日，新芽基因首席科学顾问、西湖大学常兴教授团队在Circulation期刊（IF：29.690）上发表了题为“Therapeutic Exon Skipping via a CRISPR-guided Cytidine Deaminase Rescues Dystrophic Cardiomyopathy In Vivo”的文章。

该文章首次在全新的小鼠Dmd^E4模型上复现了人类杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）患者的扩张性心肌病和心脏纤维化等心脏异常表型。利用Dmd^E4小鼠模型，一次性全身注射靶向性胞嘧啶脱氨酶介导的碱基编辑器（Targeted AID induced Mutagenesis，TAM），使Dmd^E4小鼠心脏的肌营养不良蛋白（Dystrophin）恢复了90%的表达，且心肌和骨骼肌功能明显改善，Dmd^E4小鼠的生存期显著延长。

杜氏肌营养不良（又称假肥大性肌营养不良，DMD）为一种致死性的X性连锁隐性单基因遗传病，是进行性肌营养不良病中最严重与最常见的一种，其发病率为1/3500男孩。通常3~5岁出现临床症状，随着病情的逐渐恶化，12~13岁前丧失行走能力，20岁左右死于呼吸衰竭或心力衰竭。本病是由肌萎缩蛋白（dystrophin或称肌营养不良蛋白）基因突变导致的，约 1/3 病例为散发，无家族遗传史。现行的治疗手段只能有限地延缓疾病进程，基因治疗为该病的有效治疗，甚至治愈带来了曙光。，然而现在并没有有效的治疗手段，部分原因也是因为没有合适的疾病模型。

常兴教授团队首先通过心脏超声、micro CT、肌力测试和组织学等方法验证了在DMD基因4号外显子中4个碱基缺失导致移码突变的Dmd^E4小鼠模型表现出心肌和骨骼肌功能缺陷。新生3天的Dmd^E4小鼠注射靶向DMD 基因4号外显子的AAV9-sgRNA和优化后的AAV9-CRISPR/Cas9-AID（eTAM）2个月后，肌酸激酶（creatine kinase，CK）水平明显降低，且肌肉张力得到明显改善，而心脏纤维化明显降低（图1）。

图 1

通过生物学分析，发现Dmd^E4小鼠心脏的Dystrophin蛋白在mRNA水平实现了明显的外显子跳跃（图 2）。

图 2.

在心脏组织的蛋白水平上，Dmd^E4小鼠治疗后的Dystrophin蛋白恢复可高达90%（图 3）。

图 3.

通过免疫荧光试验，再次证实了eTAM治疗后Dmd^E4小鼠心脏的Dystrophin的表达，并与维持肌细胞膜稳定的Dystrophin相关蛋白质复合物中另一个重要蛋白α-Sarcoglycan共定位在肌细胞膜周围（图 4）。

图 4.

治疗12个月后，Dmd^E4小鼠心脏组织中仍然能观察到明显的Dystrophin蛋白表达，这为后续临床上长期稳定的治疗效果提供了理论基础。不仅如此，与未治疗的Dmd^E4小鼠相比，eTAM治疗后的Dmd^E4小鼠寿命显著延长。

目前，DMD的基因治疗药物主要为基因替代疗法，许多以重建正常的肌萎缩蛋白表达为目标的基因治疗处于临床前和临床试验阶段，虽然此疗法的潜力巨大，但由于诸多技术难题尚未解决，目前的效果不甚理想。基因治疗DMD的主要困难在于人类肌萎缩蛋白基因太大，是目前已知的最大基因，其cDNA 长达14kb，多数病毒基因载体难以包装运载，尽管腺病毒等少数病毒基因载体及一些非病毒基因载体可以装载大片段基因，但多种因素导致其最终的运载效率低下，需进一步优化。早期对于临床症状轻微的贝式肌营养不良（BMD）研究发现患者肌萎缩蛋白基因缺失了第17~48号外显子，缺失占整个基因的46%。据此，研究人员克隆构建了缩短的dystrophin基因，即mini-肌萎缩蛋白。经转基因鼠模型验证，此基因编码产物基本可以满足机体的正常生理机能需求。此外，有研究人员通过敲除该基因编码中央杆状区部分片段，构建了进一步缩短的micro-肌萎缩蛋白。micro-肌萎缩蛋白功能上能够重建肌纤维的稳定性，但由于它缺失Mark2-结合位点（第26和23外显子），无法纠正患者肌卫星细胞的极性缺陷，而肌卫星细胞正常极性是其修复受损肌纤维的条件之一。因此，发展包含Mark2-结合位点的micro-肌萎缩蛋白基因用于基因治疗，有利于重建健康的肌卫星细胞，进而提高其临床疗效。另外，目前慢病毒介导的micro-肌萎缩蛋白基因的传递效率虽然较低，但它成功将micro-肌萎缩蛋白基因导入一部分肌卫星细胞，保持肌萎缩蛋白在成肌细胞持续表达数年之久。因此，鉴于肌卫星细胞的持续自我更新及分化特性，将它作为基因治疗的主要目标细胞有利于提高疗效的持久性。

除了上述的基因治疗策略外，另一种有潜力的较早提出的治疗策略是反义寡核苷酸技术介导的外显子跳跃剪接。主要原理是：反义寡核苷酸与肌萎缩蛋白基因pre-mRNA 突变外显子相应区域特异结合，干扰其剪接，导致跳过此突变外显子进行剪接，恢复了肌萎缩蛋白基因mRNA的正确读码框架，进而恢复了肌萎缩蛋白的部分功能。临床前动物试验及体外人细胞试验中表现出了一定的治疗效果，但由于导入细胞内的反义寡核苷酸稳定性较差，导致其疗效持续时间较短。

基因编辑技术的发展为直接在基因组水平精确高效切除肌萎缩蛋白基因突变外现显子成为可能，尽管当前的技术难题较多且潜在的治疗流程繁琐，需要针对每位患者不同的突变对其进行个性化治疗，但其临床应用潜力巨大，据估计此疗法可以切除近80% DMD患者的致病突变。西湖大学常兴教授团队采用的eTAM技术作为一种高效的碱基编辑器，可以通过在一段时间内，将肌肉细胞中突变的DMD基因进行原位修复而不需要AAV的长期表达。被修复的肌肉细胞自己表达有功能的蛋白，从而可以达到一次治疗终生治愈的目的。eTAM技术还有潜力通过外显子跳跃治疗更多的其它人类单基因遗传病。

参考资料：

Li J., Wang K.Y., Zhang Y.C., et al. Therapeutic Exon Skipping via a CRISPR-guided Cytidine Deaminase Rescues Dystrophic Cardiomyopathy In Vivo. Circulation (2021)

来源：新芽基因&细胞与基因治疗领域

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