基因治疗载体AAV引起的固有免疫应答与体液免疫应答概述

以AAV为载体的体内基因治疗数据，尤其是临床试验数据提示AAV载体在低剂量给药时，免疫反应不强烈，但在高剂量给药时可能引起较为强烈的炎症免疫反应，对组织器官表现出毒性效应（也有报道称发现独立于炎症之外的毒性，在此本文不予以讨论）。此外，针对AAV载体及其治疗基因产物的免疫反应还会抑制其药效。因此，有必要对AAV感染的免疫应答包括固有免疫与适应性性免疫应答做深入研究，指导最佳的药物策略或方案，一方面确保AAV基因治疗的安全性，一方面提高AAV基因药物的药效。

当AAV载体进入人体细胞后，体内抗原提呈细胞（例如DC、巨噬细胞等）经模式识别受体（例如TLR9、TLR2等）检测识别到AAV载体上的病原体相关分子模式，激活下游的相关信号通路，活化NF-κB（nuclear factor kB）、IRF（IFN-regulatory factor）等转录因子，它们分别在诱导促炎证因子及I型IFN方面发挥核心作用，上述信号通路激活诱导的细胞因子可刺激抗原提呈细胞的成熟，上调MHC及其一些共刺激因子的表达。当抗原提呈细胞迁移至淋巴结后，将AAV载体抗原肽提呈给淋巴细胞，致敏抗原特异性T细胞，激活特异性免疫反应。

模式识别受体

Toll 样受体（TLR）是一类跨膜受体，参与机体免疫。哺乳动物中已发现Toll样受体家族成员有11个。其中研究较为清楚的是TLR2，TLR4，TLR5和TLR9。TLR如同固有免疫的眼睛，监视与识别各种不同的病原体相关分子模式（PAMP）。有些TLR家族成员不但可识别外源的病原体等异物，还可识别内源性物质及降解物。TLR9是识别CpGDNA的模式识别受体，它可通过激活单核／吞噬细胞系统信号转导，活化NF―κB、AP-1，从而大量释放TNF-α、IL-1、IL-6和IL．12等多种前炎症细胞因子，引起急性炎症反应、脓毒症甚至休克。TLR2是Toll样家族中识别配体范围最大的一类Toll样受体，能够识别包括脂蛋白，脂多肽，脂壁酸(LTA) 阿拉伯甘聚糖(LAM)及酵母多糖等在内的多种配体，激活后的TLR2可以在免疫系统中发挥重要作用，引发特异性免疫反应。TLR对配体的识别，不同类型的TLRs可以组合，从而识别不同的PAMPs，如TLR7可能同TLR9组合来介导CpG激活免疫细胞。其中TLR4/TLR4和TLR9/TLR9是以同源二聚体的形式进行；而TLR2/TLR4、TLR2/TLR6和TLR7/TLR8为异源二聚体，还有的二聚体中有一个亚单位尚未确定，如TLR3/TLR、TLR5/TLR。

图1. TLR及其信号通路(Zhao et al, Frontiers in immunology, 2014) 

血液中的浆细胞样DC（pDC）、肝脏中的库普弗细胞等细胞的TLR9是识别AAV基因组核酸（尤其是未甲基化CpG DNA）的主要模式识别受体，有研究人员用单链AAV载体体外刺激小鼠来源的pDC,结果在其培养上清中检测到了I型IFN的增加。采用人外周单个核细胞（PBMC）得到了类似的结果。临床前研究也证实了TLR9-MyD88信号通路活化是靶向肝脏和肌肉等AAV基因疗法中免疫激活的原因之一。单链AAV载体刺激TLR9敲除小鼠的pDC，未表现出IFN分泌的增加。采用TLR9抑制剂处理人pDC后，单链AAV的刺激便不能增加IFN的分泌。此外，研究表明AAV载体刺激pDC分泌IFN的效应与AAV载体血清型及装载的基因元件类型无关。以单链AAV载体刺激小鼠的巨噬细胞、库普弗细胞、人单核细胞等，未见I型IFN的分泌增加。上述结果表明TLR9是pDC内识别AAV载体的病原体模式识别受体。pDC是体内产生I型IFN最重要的细胞，其产生I型IFN的效率是其他细胞的一百倍以上。近期JL Shirley et al发文称：I型IFN是诱导特异性免疫中抗AAV衣壳CD8+T细胞反应的重要因素，固有免疫细胞pDC与cDC协同作用激活特异性免疫反应中的CD8+ T细胞免疫反应，其中TLR9对于pDC是必须的，对于cDC来说，TLR9显得不重要，其中pDC通过TLR9监测AAV载体的入侵，cDC负责AAV衣壳多肽抗原的提呈(见图2)。TLR9敲除小鼠通过过继输注野生型小鼠pDC可恢复其针对AAV衣壳的CD8+ T细胞免疫反应。上述研究表明pDC中TLR9固有免疫信号通路是后续适应性细胞免疫CD8+ T激活的重要因素。

图2 固有免疫细胞pDC与cDC协同激活CD8+ T特异性细胞免疫反应（JL Shirley et al, Molecular Therapy, 2020）

小鼠体内实验结果显示经门静脉注射单链AAV载体后，其肝内MyD88、I型IFN、炎性细胞因子等表达了增加了3~4倍。自身互补性AAV诱导固有免疫反应比单链AAV强烈很多，其诱导增加的炎症因子种类更多。TLR敲除的小鼠被scAAV诱导的固有免疫反应相比野生型小鼠低很多，其中IL-6、MCP-1和TNF-α几乎与未给药组一致。

研究发现不含核酸成分的空壳，也可诱导肝脏产生炎性因子，说明存在可以识别AAV载体衣壳模式识别受体。早期人们发现TLR2可以识别细菌及支原体的酰基脂蛋白，后发现病毒衣壳（例如腺病毒衣壳）也可以被TLR2识别。加上AAV空衣壳可以诱导肝脏TLR2表达增加，人们考虑到TLR2也许是AAV衣壳的模式识别受体。以AAV空衣壳刺激稳转TLR2的293细胞系（HEK293/hTLR2-CD14），其下游报告基因表达量显著增加，而野生型293细胞其下游报告基因表达量与刺激前相比无变化。表明TLR2是AAV衣壳上模式的识别受体。以AAV空衣壳刺激肝脏库普弗细胞，其TNF-α、IL-1β等炎性因子表达量增加。若以抗TLR2的抗体处理库普弗细胞后再用AAV空衣壳刺激，则表达炎性因子的水平明显被抑制，肝窦内皮细胞的反应与肝脏库普弗细胞类似。说明在肝脏内这两种细胞可以被AAV载体经TLR2途径激活肝脏内固有免疫反应。

除了AAV基因组及其衣壳诱导的固有免疫反应外，近期研究结果显示，其dsRNA也许作为病原体相关模式参与了针对AAV载体的固有免疫，这也就解释了一些临床实验中给药AAV载体数周后才出的现针对AAV载体的特异性细胞免疫反应。研究显示AAV载体的ITR可作为启动子启动dsRNA的表达，dsRNA可以激活MDA5（melanoma differentiation-associated gene-5），促进Ⅰ型IFN的表达。MDA5是胞浆内核酸受体,与病原相关分子模式（PAMPs）相结合,特异性地识别较长的双链RNA,通过自身级联激活和招募结构域（CARD）与接头蛋白CARD同源相互作用之后,与接头蛋白线粒体连接蛋白（MAVS）结合,相互作用后会导致RIG-Ⅰ样受体（RLR）在内膜上重新定位,一边招募来TRAF2/TRAF6活化IKK激酶复合物,从而激活转录因子NF-κB;另一边招募来TRAF3和TBK1,从而促进IRF3的磷酸化激活,活化后的转录因子NF-κB及IRF会进入细胞核,共同协作促进Ⅰ型IFN基因的表达。体外抑制MDA5活性，可降低Ⅰ型IFN的表达，提高AAV的转基因表达率。

IRF信号通路

IRF作为转录因子，可以与I型IFN的病毒诱导类增强子元件结合，并诱导I型IFN的表达。I型IFN可诱导数百个与抗病毒相关的基因表达，敲除I型IFN的小鼠很易受到病毒感染，表明IRF信号通路在抗病毒免疫反应方面的重要性。

根据其它病毒诱导pDC分泌I型IFN研究结果推测可AAV载体激活TLR9-MyD88-IRF信号通路大致过程。AAV载体经pDC内吞或感染进入其胞内，病毒的未甲基化的CpG DNA被细胞内涵体膜上TLR9识别结合，启动TLR9-MyD88-IRF信号通路，MyD88通过同嗜相互作用招募MyD88和IRAK家族成员，IRAK激活下游的IRF-7，活化的IRF-7进入细胞核，与干扰素基因上的相关调控元件结合，激活I型IFN基因的表达。

NF-κB信号通路

核因子-κB (NF-κB)/Rel 蛋白包括 NF-κB2 p52/p100、NF-κB1 p50/p105、c-Rel、RelA/p65 和 RelB。这些蛋白起到二聚化转录因子的作用，可调节基因表达，并可影响到各种不同的生物学过程，包括先天和适应性免疫、炎症、应激反应、B 细胞发育和淋巴器官形成。在经典（典型）信号通路中，NF-κB/Rel 蛋白与 IκB 蛋白结合并受到其抑制。促炎细胞因子、脂多糖 (LPS) 、生长因子以及抗原受体激活一个 IKK 复合体（IKKβ、IKKα 和 NEMO），后者将 IκB 蛋白磷酸化。IκB 磷酸化导致其自身泛素化以及蛋白酶体降解，释放 NF-κB/Rel 复合体。活性 NF-κB/Rel 复合体进一步由翻译后修饰（磷酸化、乙酰化、糖基化）作用激活，并转运入胞核，在核内单独或联合其他转录因子，诱导靶标基因表达。细胞表面的TLR2与AAV衣壳上病原体相关模式或细胞内涵体上的TLR9被AAV基因病原体相关模式结合后，激活MyD88，招募相关蛋白，产生信号级联反应，最终导致 IκB磷酸化，释放NF-κB，游离的NF-κB入核，与相应的DNA元件结合位点结合，激活靶基因的表达。scAAV尾静脉给药2h后即可在小鼠肝脏检出NF-κB亚基表达增加，同时参与此信号通路的TLR2、TLR9、MyD88、炎性因子表达均增加。若给药前1天，注射小鼠抑制IKKβ与IKKα活性的药物，即可降低此信号通路激活所引起的细胞因子的表达，表明AAV载体引起的肝脏炎性因子的瞬时增加与NF-κB信号通路相关。

目前在临床AAV基因治疗中免疫抑制药物主要采用类固醇药物。以糖皮质激素为例，糖皮质激素进入细胞内便与其相应的受体结合形成复合物，此复合物能够向细胞核移行，并作为转录因子促进核因子κB抑制蛋白基因（IκB）表达，生成IκB分子。NF-κB虽然是与白介素-6（IL-6）等多种细胞因子和免疫球蛋白的基因表达有密切关系的转录因子，但在细胞中仍以与IκB分子结合的状态存在。在蛋白激酶的作用下，IκB分子磷酸化后从NF-κB解离，NF-κB向细胞核移行诱导相关炎症免疫基因表达。由于IκB分子是NF-κB抑制因子，大量表达后能够抑制NF-κB的活性，进而减少了免疫细胞产生细胞因子，T细胞激活受到影响。

除了上述激素药物外，还有多种固有免疫抑制策略被用于临床及临床前研究（载体改造、抗体靶向、蛋白酶体抑制剂等）。早期固有免疫反应的强弱是影响整个免疫反应的关键因素，因此早期固有免疫反应抑制策略，有助于降低AAV基因治疗炎症副反应，抑制针对AAV载体的适应性免疫反应，对提高AAV基因治疗的安全性及长期有效性具有重要意义。

体液免疫应答

临床研究表明适应性免疫反应是降低AAV基因治疗效果或引发安全性问题的重要因素之一，因此有必要对AAV引发的适应性免疫作深入研究，对于AAV载体有效及安全的临床应用具有重要的指导意义。下面就AAV引发的体液免疫应答作一概述。

人是多种血清型AAV的自然宿主，尽管AAV在人群中流行率较高，很多人也存在针对多种血清型AAV载体的预存体液免疫与预存细胞免疫，但目前仍旧普遍认为AAV载体是合适基因治疗应用的较优载体之一，除了一些逃逸免疫反应的策略外，还因为有研究表明对于一些血清型（例如AAV5、AAV8、AAV9），多数其中和抗体呈阳性者的中和抗体滴度相对不高，对AAV的转导影响相对低。

针对AAV的中和抗体人群流行率在地理上是不同的，且由于采用的方法不同或灵敏度等问题，有关预存AAV中和抗体在人群中的检出率存在差异。针对AAV2的阳性反应整体上最高，其检出率在30%~60%；AAV5与AAV8的中和抗体阳性率相对较低。此外，由于抗体在AAV血清型之间存在广泛的交叉反应，因此相当一部分人中可以检测出针对所有血清型的中和抗体，这种交叉反应性反映了不同AAV血清型衣壳的氨基酸序列和结构同源性，其针对AAV1和AAV2的中和抗体阳性率达70%，AAV6与AAV9的中和抗体阳性率为45%。AAV8中和抗体阳性率为38%。另外，有研究表明AAV中和抗体的滴度在人群中随年龄呈规律变化，人出生时其AAV中和抗体呈中等水平，之后逐渐降低，在7~11个月时最低，之后又逐步升高。

中和病毒的抗体亚型有多种，AAV中和抗体亚型中，IgG抗体占比最高，与AAV中和抗体滴度呈明显相关。此外，IgG1、IgG2与AAV中和抗体滴度相关，IgG3、IgG4与其无相关性，但研究发现IgG3与检测到的抗AAV T细胞反应呈相关性。

预存的AAV中和抗体会降低AAV载体的转导效率，尤其在进行系统给药时其影响更为明显。NHP与小鼠实验表明体内低水平AAV8中和抗体即可明显阻止AAV8载体对肝脏的转导，给药前预存AAV中和抗体的去除明显提高了AAV载体的转导效率，其中空衣壳诱饵策略虽然有效，但是得警惕其AAV外壳高剂量带来的免疫毒性风险。此外，针对预存AAV5中和抗体对AAV5体内转导率影响，其研究结果存在争议，一研究团队在临床试验和NHP中发现AAV5预存中和抗体对AAV5体内转导率无明显影响，但另一支研究团队近期在NHP体内得出了相反的结论，即AAV5预存中和抗体明显抑制了AAV5体内转导率。上述相互矛盾的数据表明，检测方法缺乏标准化和对体外检测的依赖使得结果比较和预测体内结果存在很大挑战。

AAV载体给药后中和抗体产生依赖于载体给药途径及载体被抗原提呈细胞摄取、提呈、CD4+T细胞活化、B细胞分化为浆细胞。研究表明固有免疫信号通路中的MyD88下调,尤其是B细胞中的MyD88的下调，显著降低了AAV中和抗体的产生。预防性免疫调节策略已被证明可以通过靶向B细胞或T细胞的免疫调节剂来预防或减弱AAV中和抗体的产生，例如：采用下调T细胞的CD4的MnTBAP，靶向CD4的抗CD4抗体，消耗B细胞的雷帕霉素或以B细胞CD20为靶点的抗体药物。然而，免疫抑制剂的选择及其治疗持续性可明显影响抗AAV抗体的产生。例如：在NHP（非人灵长类）动物实验中显示他克莫司和霉酚酸酯并不能完全阻断抗AAV中和抗体的产生，停止免疫抑制给药后，其中一只动物的AAV中和抗体水平显著升高。此外，动物实验表明AAV中和抗体是二次给药抑制AAV转导效率的主要因素，相比首次给药，二次给药后其中和抗体产生速度及产生量明显增加。

AAV中和抗体除了影响AAV转导效率外，抗AAV抗体与AAV结合后可以激活补体途径，对相应的组织器官造成免疫损伤。AAV系统给药后，一些临床试验中出现的急性免疫毒性反应可能与抗AAV抗体引发的补体途径激活有关（详见往期文章：高剂量AAV载体引起的炎症免疫毒性概述）。

针对AAV载体的体液免疫（HC Verdera et al - Molecular Therapy, 2020）

此外，抗AAV抗体可影响AAV的靶向型即影响AAV在体内的分布。研究人员采肝脏表达特异性AAV载体进行研究，给药动物5周后进行解剖，其转基因水平高的动物，载体主要分布于肝脏；转基因水平低或检测不到转基因产物的动物，载体主要分布于脾脏。推测可能是AAV与其抗体结合后形成抗体抗原复合物，与单核细胞表明的Fc受体结合，驱使载体分布于脾脏。此外，研究表明抗体与AAV的结合促进巨噬细胞对AAV的吞噬，由于灵长类动物肝脏内高比例的库普弗细胞，是其转基因水平低于小鼠的因素之一。

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