一文读懂mRNA疫苗关键技术流程

mRNA疫苗是将外源靶抗原的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞，通过在体内表达目的蛋白，刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。mRNA疫苗作为一种平台型技术，在设计和构建上具有快速性、应变性以及简单的全合成制备等优势，新型冠状病毒肺炎在全球范围爆发和蔓延后，随着Moderna和BioNtech公司的mRNA疫苗在临床上的安全性和保护效力得到进一步验证，使得mRNA疫苗技术得到广泛关注并推动了其快速发展。相比于其他类型的疫苗来讲，mRNA疫苗药学研发、生产质控等涉及诸多特殊的考虑因素，上游研究主要针对mRNA序列的设计和修饰、递送系统的选择和开发等方面，下游集中于mRNA疫苗的生产工艺的优化和高效大规模生产系统的建立。mRNA疫苗开发的关键技术流程如下：

一、模板设计、转录模板质粒构建和菌种库

（一）药物靶点的选择和DNA模板设计

通过病毒的分离鉴定、免疫原性和生物学功能研究或基因组测序和新生抗原预测技术等，明确目的抗原的氨基酸和基因序列及蛋白结构等信息，验证其在预防病毒传播或疾病控制中的作用，筛选出抗原靶标。

为了提高mRNA的稳定性，增加目的蛋白在体内的翻译效率，降低mRNA的先天性免疫水平。需要在DNA转录模板水平上对体外转录的mRNA序列进行设计和优化，mRNA的主要功能元件和优化策略见图1，主要包括ORF区密码子、GC含量优化，修饰、序列改构（如引入信号肽、额外插入有利于蛋白多聚体形成的核苷酸序列等）。转录mRNA的功能性元件：帽子结构、转录启动子、5’UTR和3’UTR、Poly(A)加尾长度的设计，对所用核苷三磷酸（NTP）类型（如将尿嘧啶修改成为1-甲基-假尿苷（1mΨ））及其修饰信息等进行设计。其中5’帽子可以保护mRNA免受核酸外切酶的影响，是翻译起始复合体eIF4F的结合位点，5’UTR和3’UTR以及polyA 尾的长度影响mRNA的稳定性和翻译的效率。核苷的修饰不仅可以增强RNA的稳定性，还可降低RNA的先天免疫反应。

图1. 体外转率mRNA的主要功能元件和主要优化策略

（二）转录模板质粒的构建

通过化学合成，PCR扩增获得设计后的抗原DNA序列，然后将其和质粒载体DNA进行相应的切割后，将二者连接完成用于RNA疫苗生产的重组质粒构建。

（三）种子库的建立和检定

将合格的重组质粒转化至大肠杆菌工程菌，经克隆筛选后建立种子库系统（主菌种库和工作菌种库）。为保证种子库无外源因子污染及目的基因序列和其他元件的准确性，对种子库进行全面检定，包括革兰氏染色、生化试验、16S rRNA测序、抗生素抗性检测、外源噬菌体检测、质粒酶切分析等。并开展种子库遗传稳定性分析，以明确各级种子库的限定传代代次。

二、原液与制剂的生产和质量控质

（一）mRNA原液生产与质控

mRNA原液生产一般分为两个阶段：

（1）制备DNA转录模板

转录模板制备一般通常通过大肠杆菌发酵来扩增DNA、DNA纯化、质粒DNA的线性化等流程获得。此阶段关键的质控项目包括序列准确性、线性化率、模板浓度、纯度、杂质残留、内毒素等。

mRNA测序准确性不如DNA测序且受限于其转录长度，因此对转录模板DNA测序是确保转录出正确序列mRNA的前提。毛细管电泳可对不同类型DNA（超螺旋、环状、线性）进行较好的区分，常用于模板DNA的线性化率的检测。

转录模板中的杂质（如质粒DNA抽提过程中残留的宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白、RnaseA）会显著影响体外转录反应和转录mRNA的质量，需对模板的纯度进行严格的质控。宿主菌蛋白残留一般用荧光染色法进行检测，残留宿主DNA的检测常基于定量 PCR (qPCR)的方法。

（2）体外转录（In Vitro Transcription，IVT）制备mRNA

mRNA制备通常包括以DNA为转录模板进行mRNA体外转录、mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶处理、mRNA纯化等步骤。其中加帽可在转录过程中进行，也可作为单独的步骤在转录后进行；mRNA核苷酸修饰、加Poly(A)尾通常在转录过程中进行。此过程需要的主要辅料包括核苷酸和修饰核苷酸、5’-帽类似物、用于mRNA体外合成大量使用的各种酶（如T7转录酶、加帽反应过程中添加的酶等）和缓冲液、纯化介质（层析柱、磁珠、过滤膜）及溶剂等。针对此步骤，赛默飞除可提供研发端的各种体外转录试剂盒（MEGAscript™ T7、mMESSAGE mMACHINE™ T7、mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA 体外转录试剂盒）以外，还可提供适用于工业级规模化生产的TheraPure试剂：包括用于体外转录的T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶、核苷酸和修饰核苷酸；加帽酶、2’-O-甲基转移酶、定制化学帽类似物或ARCA抗反向帽类似物、Poly(A)聚合酶；用于模板DNA和蛋白去除的DNase I、蛋白酶K等；所有试剂均具有超高纯度且不含动物源成分，均受监管支持且已经成功应用于核酸治疗。

IVT过程中杂质的污染会极大地影响mRNA疫苗的安全性和效力，被引入人体细胞的双链RNA和DNA-RNA杂交分子等能被细胞模式识别受体识别触发先天免疫反应，诱导I型干扰素的表达，降低蛋白质的翻译。因此对mRNA纯化步骤至关重要，目前新冠疫苗生产工艺中采用Oligo dT柱、LiCl沉淀法、硅胶柱等多种纯化技术对体外合成的mRNA中污染物进行去除。mRNA的纯化工艺主要包括切向流过滤TFF和层析工艺。首先，使用TFF装置对样品进行纯化、浓缩及缓冲液置换。接下来，使用层析填料进一步纯化。以Oligo dT柱层析为例，赛默飞生物工艺的POROS Oligo (dT)25由脱氧胸腺嘧啶(dT-25) 配体组成，通过特有的linker连接到50μm POROS基质上，dT-25配体通过 AT 碱基配对与带有polyA 的 mRNA 分子结合，可以特异性亲和捕获mRNA的polyA尾巴，在中性或高盐条件上样，低盐或纯水洗脱，收率能够达到90%以上的水平。

图2 POROS Oligo(dT)25亲和填料

mRNA原液的质控项目包括mRNA含量、纯度、产品相关杂质（如不完整mRNA、双链RNA等）、工艺相关杂质（如微球残留、蛋白酶残留、DNA模板、有机溶剂、金属离子）等。还包括mRNA的核酸序列正确性、加帽率、PolyA尾长度等结构相关的质控项目。

RNA含量一般用紫外分光光度法进行检测，序列正确性可通过Sanger测序进行确认。加帽率、PolyA长度以及修饰核苷酸检测一般采用质谱法，是mRNA质控的重点和难点。赛默飞的Orbitrap高分辨质谱核酸分析平台，可以实现mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、杂质鉴定及定量等功能，为疫苗开发和质控提供更精确可靠的数据。

图3 Orbitrap 高分辩质谱核酸分析平台

案例分享

编码新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)样品分析，首先用反相离子对色谱检测mRNA样品纯度，如下图a所示。采用上述mRNA mapping分析平台，从前处理到液质表征分析，得到如下结果：图b显示mRNA样品经过RNase T1酶解后的总离子流图，由于部分酶解，得到的片段较长，具有高特异性；对于长度3900nt的mRNA样品，在该分析流程下，仅用RNase T1酶，即可获得98.5%序列覆盖度结果。

图a 反相离子对色谱检测mRNA样品纯度（点击查看大图）

图b: Spike Protein mRNA digested with T1（点击查看大图）

图c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA（点击查看大图）

（二）制剂的生产与质控

脂质纳米颗粒（LNP）是现阶段mRNA疫苗采用的主要递送体系，其直径100纳米左右，成分包括中性脂质、阳离子脂质、胆固醇、PEG-脂质。可以有效负载mRNA分子，保护mRNA分子免受酶促降解，提高mRNA分子的内化效率。mRNA包封/装载的过程一般系以聚阳离子材料或正电荷脂质等材料与mRNA复合（complexing）后直接成粒，或成粒后再经包覆形成核壳形结构的过程。还包括后续纯化步骤，以去除未包封/装载的mRNA、游离的聚合物或脂质材料。

制备递送物质及其与mRNA的复合、颗粒成型等系mRNA疫苗的关键工艺步骤。目前工业放大工艺多数采用微流控混合技术来制备LNP，将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相后，将两相溶液注入制备系统的两条入口通道，一端是RNA的水溶液，一端是脂质的乙醇溶液，通过两相的快速混合，完成核酸脂质纳米颗粒的合成。改变流体注入速度和比率，可以控制脂质纳米颗粒的粒径大小。

对LNP的质控重点项目有：复合率和/或包封率、pH、平均粒径及粒径分布、粒子微观形态、Zeta电位、渗漏/释放的评价等。

针对LNP的一些质控项目和方法

LNP的粒径分布以及Zeta电位可通过配套的粒度分析仪进行检测。核酸浓度、mRNA包封率项目可以通过A260法或荧光分析法进行检测。冷冻电镜可以在不破坏纳米粒子的结构前提下对LNP的形态进行观察，是常用一种对LNP形貌进行表征的手段。高效液相色谱法（HPLC，Thermo Scientific™ Dionex™ ICS-6000 HPLC™ 系统）是一种有效质量控制的手段，可对LNP各组分如胆固醇、PEG的鉴定和含量则用进行分析。

新冠肆虐2年，此起彼伏，唯有预防和治疗齐头并进，才能适当抑制疫情。相较于传统疫苗，我们看到了mRNA疫苗的诸多优势，它潜力无限。赛默飞作为科学服务领域的领导者，从mRNA药物研发到大规模商业生产，可以提供完整的解决方案，全线赋能生物制药创新之旅。

来源：赛默飞

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