基因治疗药物载体亚可见颗粒分析方法概述
生物制药如治疗性蛋白质、疫苗、病毒、基因与细胞治疗是一个不断快速增长药物领域。在相关药物研发过程中，原料药和药品中蛋白质聚集体和不溶性颗粒是需要充分评估和控制的杂质，因为它们有可能引发免疫原性反应，影响产品的安全性和有效性。中美药典中现行的颗粒定义是10-100 nm为蛋白寡聚体，0.1-1 μm为亚微米颗粒/纳米聚集体，1-100 μm是亚可见颗粒/微米聚集体，>∽100 μm是可见颗粒。不同于治疗性蛋白质产品，基因治疗产品大多采用病毒作为载体包括腺病毒（AdV）、腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）或溶瘤病毒(Oncolytic Virus)等，所以产品中颗粒包括细胞、病毒和脂质纳米颗粒等，可通过大小、形态、含量和浓度的分析技术来表征。基于病毒载体的基因治疗产品剂型主要是注射剂，其亚可见颗粒分析方法可参考USP787、788和789对治疗性蛋白质注射液和眼科溶液中亚可见颗粒的规定。但由于病毒颗粒异质性和复杂性，以及对最终产品的有效性和安全性的可能影响，如降低病毒的转导效率和诱发免疫原性反应等，所以需要多种不同技术和方法联合使用，实现更全面更准确的基因治疗产品颗粒表征。
以rAAV载体的基因治疗产品为例，病毒颗粒本身是无包膜的，二十面体结构，直径约为25nm，可形成各种不同大小的变体和聚合形态。目前有多种技术来表征相关产品溶液中颗粒大小，从纳米级到肉眼可见级别，对于不同粒径大小颗粒可采用不同技术进行分析表征。对于纳米级别颗粒，可采用动态或静态光散射（Dynamic or Static Light Scattering）、SEC-HPLC、电镜（EM）、原子力显微镜 (AFM)、分析型超速离心机（AUC）、纳米颗粒跟踪分析技术（NTA，Nanosight）和非对称流场流动分级（A4F）等；对于微米级别颗粒，可采用光阻法（LO）、微流成像颗粒分析技术（MFI）、库尔特颗粒计数（Coulter counter）等。可见颗粒可采用拉曼/红外显微镜、荧光显微镜或目测法等。可用于AAV颗粒分析的代表性方法参考下图。
基因治疗亚可见颗粒分析方法
微流成像颗粒分析方法（MFI）：技术原理是待测样本在流经样本检测池过程中，在固定检测窗口处，采用高频成像检测器动态连续检测样本中颗粒物，获取一系列数据照片，最终通过软件对所获取的颗粒物照片进行分类和计数分析。核心技术是通过精确地控制样本检测池中的流速，配合静态图像捕获，使相邻两次成像检测液柱无重叠，从而避免对样本颗粒的重复计数，同时需要保证85%以上样本实现了颗粒成像检测，配合全景深立体成像，保证所有检测到的颗粒都在景深范围内，实现对颗粒大小检测准确性。该方法提供了样本中颗粒真实的原位图像，对捕获的数字图像进行分析，实现了颗粒的可视化、计数、大小调整和表征。根据颗粒图像、对比度和形状，与图像数据库联合使用，可能指示颗粒的来源和类型如蛋白聚集、硅油、气泡和纤维等，有助于了解污染源和产品性质。与光阻法和显微计数法相比，缩短了分析时间，具有更高重复性和分辨率，更可满足2-10 μm范围内亚可见颗粒分析需求。 光阻法（LO）：被检测液体通过专门设计的流通室，与液体流向垂直的入射光束由于被液体中的粒子阻挡而减弱，从而使传感器输出的信号变化，这种信号变化与粒子通过光束时的截面积尺寸成正比。这种比例关系可反映粒子大小。每一个粒子通过光束时引起一个电压脉冲信号，脉冲信号多少反映了粒子数量。光阻法检测颗粒范围为1∽300 μm（USP 40<1787>）。以光阻法为原理设计的微粒检测仪主要包括取样器、传感器和计算机控制的检测和数据处理系统。不同设备测量粒径范围涵盖了2∽100μm，检测粒径浓度为0∽10000个/ml，取样体积为0.2∽100 mL。符合药典对大小容量注射液和粉针剂不溶性微粒检测需求。其主要优势是可直接观察溶液中颗粒，具有大量历史数据的药典推荐方法，操作简单。劣势是对比度低，可能会低估制剂配方中形成的不可见蛋白质颗粒，对气泡敏感，某些脱气技术会改变样本性质，更重要的只适合表征颗粒大小和分布，不能通过形态来分析颗粒。
电感应区检测方法：基于库尔特原理检测颗粒，可检测0.4∽1600μm范围内颗粒（商业化库尔特颗粒计数及粒度分析仪有差异）。稀释悬浮在电解液中的样本颗粒通过小孔管时，取代相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，从而中断电场，产生电位脉冲，信号响应不受颗粒类型影响（如颜色、硬度、不透明度和折射率变化）。脉冲信号大小和次数与颗粒大小和数目成正比。本技术优势不受溶液光学特性影响，可实现单孔中高通量样本检测。劣势是需要大样本体积，需要较低颗粒浓度，有时样品必须在电解质溶液中稀释获得足够电导率，可能会改变样品性质，同样也不能提供形态学参数。
显微计数法：采用光学显微镜（LM）检测和分析颗粒，光在样品上透射或反射后通过一系列透镜，直接采用目镜观测或数码相机采集信号成像。图像分析可使用软件系统，按照一定参数对颗粒群体进行分析。优势是可直接观察溶液中颗粒，可视化计数颗粒大小和数目，并鉴别颗粒形态。可与红外或拉曼技术整合来鉴定颗粒化学组成。但劣势是人工分析费时费力和通量低，难以看到低光学对比度颗粒，自动化程度低。
颗粒鉴定表征可采用傅里叶红外光谱（FTIR）显微镜、显微拉曼光谱和扫描电镜-能谱分析（SEM-EDS）等技术，本文不做深入论述。
颗粒分类中亚可见颗粒是一种聚集形式，经历了相分离并变得不溶。多个国家药典规定注射剂亚可见颗粒物检测采用光阻法（LO）和显微计数法。光阻法只计数颗粒大小和数目，不能看到颗粒形态。鉴于光阻法技术局限，美国药典1787推荐了微流成像颗粒分析技术作为大小和形态表征重要互补方法。2021年中国食品药品检定研究院发表文章，详细比较了微流成像颗粒分析方法和光阻法对17种单克隆抗体的亚可见微粒分析结果，显示了微流成像颗粒分析技术在准确性方面具有优势，未来可能用于产品放行的质量控制和稳定性研究。
基因治疗产品亚可见颗粒分析案例
鉴于不溶性微粒研究在生物制品中重要性，有必要深入研究病毒载体基因治疗产品中病毒颗粒聚集体和不溶性颗粒形成原因，并找到相应地解决方案来提高基因治疗产品的研发和质量控制水平。以下案例简要说明亚可见微粒分析方案。
AAV生产过程中超滤环节将AAV浓缩并置于最终制剂配方缓冲液中，作为生产工艺中关键步骤，需要深入研究和理解AAV载体超滤技术。美国Voyager Therapeutics公司研究超滤膜截留分子量和操作条件对复合再生纤维素（CRC）超滤膜通量和传输的影响，采用两个血清型AAV2和AAV9病毒载体，以期定量理解AAV超滤行为，并指导工艺开发。利用微流成像颗粒分析方法（MFI）研究病毒浓缩超滤工艺开发过程中产生的亚可见颗粒。下图结果展示1到10μm之间颗粒采用MFI检测时存在明显差异。两个批次A和B实验，对于特定的膜批次，当处理时间较长时，亚可见微粒浓度较高。与较低TMP 6.5 psig相比，当采用更高TMP 20 psig进行超滤时，亚可见微粒浓度降低。这归因于较低TMP下超滤时，泵通过管道和通道次数增加导致，研究结论可指导超滤工艺的条件设置。MFI系统具备自动进样系统，可一次自动检测多达90个样本，非常适合AAV生产过程中工艺优化。
2.AAV基因治疗产品稳定性研究
制剂配方中AAV长期稳定性和密封容器封闭的完整性是冷冻产品的两个关键方面。为了最大限度地减少化学和物理降解，也为了长期存储和运输，AAV原料药和产品制剂通常冷冻在≤-60 °C下，有时允许产品制剂短期存储在医院2-8°C冰箱。在制造、贴标签和临床使用过程中会在室温和冷藏条件下发生冻融循环，在外暴露期间AAV稳定性也很重要。不同AAV血清型和制剂配方差异导致这期间稳定性会有所不同，所以在制剂配方早期开发过程中，确认在制造、贴标签和临床使用期间AAV稳定性数据是有意义的。
为了研究温度、存储时间和冻融率对AAV8和AAV9稳定性影响，美国REGENXBIO公司研究低浓度和高浓度病毒在五个冻融循环中，预期存储以外时间的稳定性，考察病毒关键质量属性变化情况。采用数字PCR检测病毒载体基因组浓度（GC/mL），结果显示病毒效力和浓度在方法误差范围内保持稳定。采用光阻法检测亚可见微粒（Particles/mL ≥10 μm）。下图左边第1列是配方F1中AAV8，第2列是配方F3中AAV8。每个小图中左边一对柱状图代表低浓度结果，右边一对柱状图代表高浓度结果。对照组标记为Cont.和累积预期存储时间外暴露样本标记为TOIS。实验结果显示TOIS后颗粒数非常低，≥2 μm的颗粒≤78个/mL，≥10μm的颗粒≤10个/mL，≥25μm的颗粒≤2个/mL，和≥50μm的颗粒0个/mL。在本研究设定实验条件下，结果表明AAV8和AAV9产品质量属性保持在可接受范围内，稳定性适合用于生产和临床使用。同时作者认为光阻法有局限，可能低估了半透明蛋白质颗粒和病毒聚集体颗粒，后续研究需要采用微流成像技术对亚可见颗粒进行表征和稳定性研究。
为了研究冻融条件对病毒载体稳定性影响，美国堪萨斯大学疫苗分析和制剂中心科学家（Vineet Gupta，2022，Journal of Virological Methods）研究了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）载体稳定性，使用TEM、NTA和MFI三种互补病毒颗粒表征技术来研究病毒载体在冻融应激下的稳定性。4种不同制剂配方（Form 1-4）在0、3和6个冻融循环条件下亚可见颗粒变化，研究冻融对病毒载体稳定性影响。参考下图，结果证明了通过MFI可检测到样本中存在大量的亚可见微粒。结果表明某些制剂（制剂F1和F3）病毒载体亚可见颗粒浓度与病毒载体滴度损失之间存在负相关，制剂配方2和4没有变化。
与上述研究类似，Kumru,2015等观察到在冻融循环时，特定配方中溶瘤单纯疱疹病毒1体外效力值和亚可见颗粒浓度之间呈现负相关。基于以上多项研究，不同制剂配方中观察到结果可能有所不同，所以在评估病毒感染能力和稳定性时，需要同步进行亚可见颗粒研究。
综上所述，基因治疗产品在研发、生产、存储等多个工艺过程中需要持续监测样本中颗粒情况，从早期到晚期开发阶段都需要监测颗粒的动态变化过程，探索研究病毒聚集体和颗粒产生的原因。可采用多种不同分析检测技术联合使用，针对纳米级和微粒级颗粒进行全范围覆盖。亚可见微粒检测可参考中美药典对不溶性颗粒检测规定，借鉴生物大分子蛋白质药物颗粒分析经验，不同方法优势互补，采用光阻法、显微计数法和微流成像颗粒分析方法（MFI）对其进行深入研究，分析基因治疗原料药和药品中颗粒形成原因，可用于优化病毒载体生产和纯化工艺、筛选合适制剂配方和存储条件，提高产品质量稳定性和安全性，保证产品疗效。
参考资料：
1.Alexandra Roesch, Sarah Zolls, et al. Particles in Biopharmaceutical Formulations, Part 2: An Update on Analytical Techniques and Applications for Therapeutic Proteins, Viruses, Vaccines and Cells. Journal of Pharmaceutical Sciences(2021) 1−18
2.于雷，裴德宁等. 基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性研究. 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2020,40(1)
3.Andrew D.Tustian, Hanne Bak. Assessment of quality attributes for adeno‐associated viral vectors. Biotechnol Bioeng. 2021;1–18.
4.United States Pharmacopeia <787>.Subvisible particulate matter in therapeutic protein injections. <788>. Particulate Matter in Injections. <789>. Particulate Matter in ophthalmic solution. <1787>. Measurement of subvisible particulate matter in therapeutic protein injections. <1788>. Methods for the determination of subvisible particulate matter. Rockville, MD: United States Pharmacopeial Convention;
5.2020年版药典，0903 不溶性微粒检查法
6.Abhiram Arunkumar, Nripen Singh. Ultrafiltration behavior of recombinant adeno associated viral vectors used in gene therapy. Journal of Membrane Science, volume 620,2021
7.Jared S. Bee, Yu (Zoe) Zhang, et al. Impact of Time Out of Intended Storage and Freeze-thaw Rates on the Stability of Adeno-associated Virus 8 and 9. Journal of Pharmaceutical Sciences (2022) 1−8
8. Vineet Gupta, Lorena R. Antunez, et al. Development of a high-throughput RT-PCR based viral infectivity assay for monitoring the stability of a replicating recombinant Lymphocytic Choriomeningitis viral vector. Journal of Virological Methods 301 (2022) 114440
转载自：医麦客
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