AAV药物关键质量属性及其分析质控难点

（派真生物质量分析和检测团队原创）重组腺相关病毒载体（rAAV）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。与传统小分子和大分子药物相比，现有的分析技术不能满足AAV的分析质控需求，需要开发全面的新型分析测试方法来表征AAV和证明其安全性和有效性。本文旨在讨论AAV药物关键质量属性及其分析质控难点。

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AAV药物开发不同阶段对于AAV专属性分析的要求

AAV药物早期开发分为药物开发、工艺开发和中试生产三个阶段，不同阶段在测试分析需求上有所差异。在AAV药物相应控制的质量属性也存在较大的差异。三个阶段重点关注的测试分析重点见下表：

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CMC过程中AAV质量控制阶段的关键质量属性

根据ICH Q8，除了一般特性外，还包括鉴别、含量及效价、纯度、杂质、安全性几个方面的关键质量属性。基于已上市的3款AAV药物及FDA等审评中心的发表意见，我们总结AAV在CMC过程中，AAV质量控制的关键属性一般的设置如下表。其中品种专属的质量属性空壳率、感染滴度、rcAAV检查分别代表了AAV在纯度、效价、安全方面的关键指标，目前在CMC阶段受监管机构的重点关注。派真生物针对下列质量属性已开发约40多套平台检验方法，几乎全面覆盖CMC阶段表征和质控的要求，并能提供分析方法验证/确认，批放行等服务，助力企业提交IND申报。

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AAV的鉴别项目

AAV的鉴别项目通常采用SDS PAGE或者CE-SDS可以实现AAV结构蛋白VP1、VP2、VP3的鉴别，采用Sanger测序对特征序列进行测序鉴别。作为CDMO公司，我们同时可能会进行数个产品的生产，对于血清型的鉴别我们还采用包括液相质谱平台对血清型结构蛋白序列进行鉴别。

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AAV定量分析的方法

在检测AAV的含量时，通常采用基因组滴度或者衣壳滴度作为单位。基因组滴度一般采用荧光定量PCR、ddPCR、染料法、UV/Vis等方法来测定基因组滴度；衣壳滴度主要是通过ELISA、HPLC、SEC MALS等方法来测定衣壳滴度。qPCR和ddPCR这两种方法使用较多。qPCR的缺点是对PCR抑制剂敏感，同时存在引物扩增效率偏好，方法精密度较差的特点。基因组滴度检测采用ddPCR（微滴式数字PCR）在精密度上获得较为满意的结果，且该方法绝对定量，无需标准品，精密度良好、回收率高，也可用于裂解液中间品。派真实验室采用了qPCR和ddPCR对不同的靶基因进行了检测，结果表明ddPCR具有更好的精密度，可获得较为稳健的结果。

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工艺开发过程中的杂质研究

一般包括宿主细胞DNA大小分布及残留、宿主细胞蛋白残留、质粒DNA残留、核酸酶残留、特定工艺相关残留（如亲和配基、BSA）、去污剂残留。对于宿主细胞DNA残留，还需关注衣壳内外残留水平差异。

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质控空壳率的意义及如何检测AAV空壳率

在AAV载体生产过程中，有空衣壳的病毒颗粒、填充了部分基因的病毒颗粒、基因组DNA过度装载的病毒颗粒的产生。空衣壳在安全上的不确定性已经引起了FDA和专家的重点关注。作为创新药物，通过生产体系优化，尽量降低缺乏目的基因的空壳颗粒、包含片段化或者部分基因组的病毒载体颗粒，以尽可能纯化获得更多高质量的包含完整基因组的病毒载体颗粒也是监管趋势所期待的。派真生物经过工艺的优化，生产的AAV空壳率经过AUC检测可控制在3%左右的水平。

对多种形态进行分析的金标准方法是分析型超速离心（analytical ultracentrifuge,AUC）。通过不同形态AAV的沉降系数不一样从而通过超速离心达到分离检测获取不同形态AAV的比例信息。

我们建议工艺开发过程为了获得更清晰的AAV表征采用分析型超速离心技术（AUC）测定空壳率，采用离子交换色谱法（AEC）进行工艺批次放行测定。

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建立AAV体外效价的评价方法

目前一般采用感染滴度、目的基因表达量、目的蛋白生物学活性来作为AAV的效价方法。感染滴度TCID₅₀是判断病毒感染性滴度的金标准。针对TCID₅₀感染滴度方法重复性不稳定的问题，派真开发了一系列控制措施，主要措施有：建立均一的辅助病毒库、建立检定用细胞工作库、基于qPCR反应的反应体系优化、人员的培训。

基因治疗药物的CMC阶段为了更好地评价AAV药品的有效性、一致性，通常需要建立体外生物学活性的方法。但AAV的体外效价开发有较高的挑战，靶细胞的选择具有较高的难度：需考虑评估AAV血清型对靶细胞的感染效率、启动子是否有效表达、与靶基因生物学的相关性及作用机制、内源性靶蛋白表达的影响等。派真在多个血清型和体外用靶细胞株的选择和感染已经形成了平台化经验，可以加速效价方法开发。

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复制性完整型AAV的检验方法

复制性完整型AAV检验是AAV药物安全性的重要指标。目前药典或文献未有可实践的复制完整型AAV检测方法，其开发难点在于需要用到经过标定的辅助病毒和野生阳性病毒，可接受标准限度低，一般方法的灵敏度不满足要求，验证难度大。通常是在P2实验室条件下采用检定用的wtAAV和样本在辅助病毒辅助下经过多轮感染靶细胞，并提取样品进行qPCR检测。派真生物开发了特有的rcAAV PackRich技术，在低至5-10 IU的阳性对照病毒下仍然能检出，同时重现性和稳健性更高。目前已经成功帮助客户提交IND申报受理。

关于派真生物

派真生物（PackGene）是一家全球领先的AAV病毒载体包装CRO和CDMO公司, 以质粒和AAV载体创新生产体系、方法学检测、以及GMP规模化生产为核心, 依托持续技术创新，为细胞与基因治疗 (CGT) 的早期研发、临床前开发、临床试验以及药物审批提供经济、快速、规模化的质粒生产和AAV病毒载体生产。派真生物以做全球基因药研发生产的合作伙伴为使命，以加速创新基因药上市为己任，精通FDA、NMPA和EMA等对基因疗法制品的规范要求，通过降低基因药物大规模生产成本，助力合作伙伴让基因药更早普惠大众。

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