肿瘤疫苗的发展：
早期治疗性疫苗设计策略集中于肿瘤相关抗原（TAA），TAA是在肿瘤中异常表达或过度表达的自身抗原，其在部分正常组织中也常有低表达。这种策略由于TAA特异性T细胞受中枢和/或外周耐受的影响，临床基本上是不成功的。另外，这种TAAs在非恶性组织中也有一定程度的表达，这增加了疫苗诱导自身免疫毒性的风险。
与之不同，肿瘤特异性抗原（TSA）只存在于癌细胞表面，而在正常组织中不表达。肿瘤的基因组中积累的突变产生的新的自身抗原表位（新生抗原）是TSA中的一类，其可通过多种机制发生，比如突变多肽、异常基因表达、病毒感染和异常转录后修饰。基于新生抗原而非传统TAAs的肿瘤疫苗有以下几个优点：1）新抗原仅由肿瘤细胞表达，因此可以引发真正的肿瘤特异性T细胞反应，从而防止对非肿瘤组织的“脱靶”损伤；2）新抗原是源于体细胞突变的新表位，它有可能绕过T细胞对自身表位的中枢耐受，从而诱导产生抗肿瘤免疫反应；3）这些疫苗增强的新抗原特异性T细胞反应持续存在并通过记忆性T细胞产生治疗后免疫记忆，为长期预防疾病复发提供了可能性。
新生抗原疫苗的作用机理：
正常的细胞在复制生长的过程中会引入随机的突变，大部分突变细胞会被人体免疫系统及时清除；某些情况下肿瘤-免疫循环被破坏，如部分突变细胞改变了会被机体免疫系统识别的位点，突变细胞会躲过免疫系统识别、转变为肿瘤细胞。肿瘤免疫疗法的关键在于重塑患者体内被破坏的肿瘤-免疫循环，激发机体本身的免疫应答来杀伤清除肿瘤细胞。肿瘤疫苗的开发在全球范围内已超过20年，其基本原理是通过靶向肿瘤相关或肿瘤特异性的抗原肽，提升免疫系统对于含此类抗原肽的癌细胞的识别与杀伤能力。肿瘤疫苗起效具体步骤包括以下四步：1）外源抗原进入机体后，被抗原递呈细胞（APC）以胞吞形式摄入，进而在胞内被水解为能与MHC-I或MHC-II类分子结合的抗原肽片段；2）通过MHC将抗原肽递呈至APC表面，形成pMHC复合物；3）通过与pMHC-TCR的互作，被MHC-II类分子递呈的抗原肽可激活CD4+ T细胞，释放多种细胞因子促使相关免疫细胞的活化和增殖，被MHC-I类分子递呈的抗原肽可激活CD8+ T细胞；4）CD8+ T细胞在pMHC I-TCR和CD4+ Th细胞的共同刺激下进一步分化形成细胞毒性淋巴细胞（CTLs），通过分泌穿孔素等细胞毒素直接杀伤靶细胞，从而实现消除肿瘤的作用。
在肿瘤的基因组中积累的突变可导致肿瘤特异性抗原的形成，这类肿瘤特异性抗原被称为新生抗原，并不存在于正常的组织器官当中。由于新生抗原的氨基酸序列不同于在健康细胞中表达的蛋白质，其可以产生具有高免疫原性的表位，当这些表位被APC提呈至细胞膜外表面后能被T细胞识别为外源的，从而引起强大的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤新生抗原疫苗同时还可以诱导产生免疫记忆效应，有效改善传统免疫疗法的耐药现象，若与其他肿瘤疗法联合还具有提升患者响应率的潜力。
图：新生抗原肿瘤疫苗的免疫响应机理图Sahin et al., Science 359, 1355–1360 (2018)
新生抗原疫苗的制备方法：
目前，业内通常根据新生抗原在患者群体内的存在分布而将新生抗原分为共有新生抗原（shared neoantigen）和个体新生抗原（personalized neoantigen）。总的来说，肿瘤新生抗原疫苗的制备过程已经逐渐系统化。以个体化肿瘤新生抗原疫苗为例，其制备流程主要包括4个步骤：收集患者的癌组织和正常组织标本、测序与突变鉴定、新生抗原预测及优选、疫苗设计及制备。通过全外显子和转录组测序获得癌组织和正常组织的基因序列，经由序列比对获得癌细胞突变基因数据；经过cDNA芯片或RNA序列（RNA-seq）检测，依照基因表达水平来选择合适的突变新生抗原；采用生物信息学和人工智能算法对新生抗原进行预测及排序，最终决定选用哪些新生抗原。最后经过疫苗设计和制备得到可以临床应用的疫苗产品。目前已有多种形式的肿瘤新生抗原疫苗，如多肽、DNA、mRNA、树突细胞等。不同形式的疫苗具有不同的制造工艺流程，制备得到GMP级别的肿瘤新生抗原疫苗可通过冷链转运等方式，运至医院进行疫苗接种。
不同新生抗原疫苗的制备方法：
目前已有不同制剂形式的肿瘤新生抗原疫苗/细胞产品正在进行临床效果评估，包括多肽，RNA/DNA核酸疫苗，细胞形式等，从设计和制备工艺上看各有优劣。
多肽：根据统计，目前临床上正在开展或者已经开展的肿瘤新生抗原疫苗项目中，多肽形式的肿瘤疫苗占了绝大多数。原因是多肽成药性和安全性非常好，同时免疫响应率较高。为了进一步提高多肽肿瘤疫苗的免疫原性，临床上常将多肽疫苗与免疫佐剂联合使用。例如NeoVax是一款在临床上较为瞩目的新生抗原多肽疫苗，它常搭配Poly-ICLC（一种合成的dsRNA，它可以激活TLR-3受体）以及其他免疫检查点抑制剂进行联合治疗。2021年1月发表在Nature Medicine杂志上的一项研究证实，在黑色素瘤患者中，NeoVax可诱导持续多年的T细胞反应，患者接受疫苗治疗4年后，疫苗引发的免疫反应依然强大，且能够有效控制癌细胞。然而，从多肽的理化性质角度，给不同病人设计的新生抗原多肽具有不同序列，理化性质差异较大，因此对于工艺路线和质量标准的开发研究难度较大。
DNA疫苗：肿瘤新生抗原核酸疫苗主要包括DNA 疫苗和mRNA 疫苗，它们都由载体和编码肿瘤抗原的基因组成。DNA 疫苗使用携带病原体遗传信息的质粒小型环状DNA 分子，诱导机体特异性免疫应答。DNA 疫苗接种后，质粒进入人体细胞，穿过细胞质，通过细胞核膜，进入细胞核。细胞核中相应的酶将质粒携带的外源性基因转化为mRNA，然后mRNA 进入细胞质中，翻译合成为蛋白质，免疫系统识别外源性蛋白质并引发免疫反应。DNA 疫苗的优点是成本低、制作简单和可进行大规模生产，在体内和体外稳定。DNA 疫苗的缺点是接种后外源基因进入宿主细胞核内、可能整合到基因组上，从而改变某些细胞的遗传信息，造成基因突变，给患者带来了患病风险。
MRNA疫苗：相较于DNA疫苗，mRNA疫苗最大的优势是在于mRNA不需要进入细胞核，因此不存在与基因组整合相关的风险。但是mRNA核酸药物由于分子量较大，分子被攻击破坏的位点较多，因此稳定性差，在体内容易被降解。此外mRNA药物的磷酸二酯键骨架使核酸的负电性和亲水性极强，因此不易跨过细胞膜，体内递送效率极低。为了突破诸多的细胞外屏障和细胞内屏障，将mRNA药物递送进入特定的靶细胞和亚细胞器，递送载体是助力核酸药物发挥效果的关键之一。由于需要额外辅料载体的封装（例如应用较为成熟的LNP），mRNA疫苗的制备工艺较为复杂。同时患者在接种肿瘤疫苗时，需要进行多次的给药，如何克服获得性抗体（例如针对PEG辅料的抗体）带来的药物加速清除是亟待解决的问题。虽然，mRNA具有一条分子链串联多个新生抗原的能力，例如mRNA-4157可最高串联34个新生抗原；但是据已有研究结果，多表位串联的mRNA疫苗的新生抗原免疫响应率整体来看略低于多肽疫苗。例如，BioNTech联合Genentech公司开发的Cevumeran（个体化肿瘤新生抗原mRNA疫苗）联合PD-L1抑制剂序贯mFOLFIRINOX 化疗用于胰腺癌术后辅助治疗的I期临床试验，针对16例患者使用的Cevumeran疫苗中所包含的230条新生抗原进行ELISpot检测，仅显示有11%（25/230）新生抗原激发了抗原特异性T细胞免疫应答。
DC疫苗：新生抗原是树突状细胞（DC）疫苗的理想靶标。DC是一类APC，负责将抗原摄取、加工和呈递给T细胞以激活免疫反应。DC疫苗可以通过多种方式靶向新生抗原，包括mRNA脉冲、合成肽脉冲和自体全肿瘤裂解物脉冲以及与肿瘤细胞融合的脉冲。DC肿瘤疫苗的优势表现在负载新生抗原的步骤可在体外进行，影响因素相对较少。然而缺点是需要进行抽血、细胞分离、诱导成熟、抗原负载、细胞扩增，操作步骤较为复杂，质量控制具有一定的挑战性。且细胞产品的长期保存及运输与常规形式的疫苗相比也具有挑战。BNT113是现货型mRNA肿瘤免疫疗法FixVac开发的候选药物，作为罹患不可切除复发或转移性HPV16阳性头颈鳞状细胞癌（HNSCC），且表达PD-L1的患者的一线疗法。