干细胞诱导生成类器官的工艺要点浅析

2022 年 12 月底，美国众议院批准了《FDA 现代化法案 2.0（FDA Modernization Act 2.0）》，FDA 不再对新药和仿制药的动物试验做强制要求，旨在倡导减少动物试验的使用，鼓励在可行的情况下逐步应用替代模型。

类器官是一种三维（3D）细胞培养系统，已被证明是临床前研究中动物模型的绝佳替代品。在 FDA 政策的推动下，我们可以屡屡见到国内外类器官和器官芯片获得融资，这一应用方向已成为生物医药投融资的一大热点。

近 10 年来，类器官市场显著增长。2010-2020 年期间，新公司增长率高达 64%；截至 2022 年 Q4，该领域的累计市场价值约为 10.31 亿美元。

2010-2022 年期间类器官市场的企业数量、市场份额

类器官是利用多能干细胞、成体干细胞等进行体外定向诱导与 3D 培养而形成的组织器官类似物，可以模拟体内组织的复杂结构及功能的许多方面，干细胞诱导生成的类器官可以用于人体组织发育、再生和修复机制方面的基础研究，也可以用于诊断、疾病建模、药物筛选评价与临床再生医学等【1，2】。此前，Nature Methods 评价类器官技术：利用干细胞诱导生成的三维组织模型，为人类生物学研究提供了强大的方法。迄今为止，文献等资料已经报道了许多干细胞诱导生成类器官培养方面的工程策略。

本文在总结前人资料的基础上，概述了干细胞诱导生成类器官的培养方法，并简要讨论了干细胞培养诱导生成类器官的关键因素，例如细胞的来源、细胞外基质和细胞因子等。

目前，按照来源，类器官主要分为三大类：

① 多能干细胞来源类器官；

② 成体干细胞来源类器官；

③ 肿瘤组织来源的肿瘤类器官。

就类器官培养的初始组织细胞来源而言，尽管有报道称，将人肾癌、甲状腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌和肾癌组织切碎，在液氮中保存一年多时间之后进行复苏及原代细胞的分离提取，对细胞进行 3D 培养，结果表明组织冻存对于细胞活力及生长速度等无显著影响【3】。但人们仍普遍认为未经冻存的新鲜组织是类器官培养的最佳选择。

类器官的制备是一项较为复杂的工程，类器官制备的经典流程是将分离出来的干细胞培养在 3D 支架上，并向培养环境中添加例如表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、成纤细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等在内的多种生长因子及其它添加物来促进相应类器官形成与生长，最后要对类器官进行鉴定。

图 1. 干细胞来源类器官培养流程示意图

干细胞诱导生成类器官需要特定的试剂耗材等物质条件（例如：特定的生长因子、3D 支架和干细胞分化诱导物等）与特定的培养条件（例如合适的温度、合适的氧气浓度、二氧化碳浓度以及一些模拟体内情况的特定力学参数等），这些是为干细胞诱导生成类器官构建一个适合其生长发育复杂微环境的极其重要条件【1】。

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类器官多种培养模式

鉴于不同物理环境条件对于干细胞组织发育成类器官至关重要，目前针对干细胞诱导生成类器官的不同培养需求开发出了多种不同物理环境状态下的培养模式，例如采用天然细胞外基质 3D 支架进行静态培养（如小肠类器官）、采用无细胞外基质支架支撑的 3D 悬浮搅拌式培养（如脑类器官）、采用气-液界面细胞团培养（如类肾器官）等（见图 2）。

图 2. 不同物理环境状态下的类器官培养【4】

其中，细胞外基质为类器官细胞生长提供合适的 3D 支架，类器官细胞外基质通过基质胶制备，基质胶在类器官制备成本中的占比较高，目前常用的基质胶为美国 BD Biosciences 公司的 Matrigel^®，一方面价格较高，一方面由于其来源于小鼠肉瘤细胞系，基质胶批次间差异问题可能导致不同实验或类器官产品间的质量不一，且成分复杂、含未知的生物成分、免疫原性等问题，为基础研究或临床转化带来一定困难，因此，体外合成的低成本、非动物细胞来源的细胞外基质将是类器官行业需要解决的重要问题之一。

但静态培养系统条件下，对供养和营养物质的供给较为困难，尤其是大体积类型的器官【5】。可以选择性使用上述提到的搅拌式动态培养系统，它可以为较大体积的类器官提供充足的氧气交换和营养物质，促使类器官的发育和维持。

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合适的生化微环境至关重要

合适的生化微环境在干细胞诱导生成类器官与类器官稳态维持方面扮演重要角色，各类细胞因子或一些诱导物对于维持干细胞的分化、类器官的发育及稳态所需的微环境至关重要，根据干细胞来源不同或制备的类器官种类不同，所需的添加物或细胞因子种类或组合也不同，即使结构非常相近的组织器官，其所需的添加物或细胞因子组合也不尽相同。就细胞因子而言，经典的细胞因子组合方案为  WENR（缩写 WENR 为四种细胞因子 Wnt- 3a、EGF、Noggin 和 R-Spondins 分别取首字母后的组合），这四种细胞因子的增减组合适用于绝大部分的类器官培养实验。

① Wnt 信号通路是一个非常复杂的蛋白质相互作用系统，在调节细胞发育、增殖分化、粘附及自我更新等多方面发挥重要功能，参与此信号通路的 Wnt 蛋白构成了一个庞大的分泌蛋白家族。其中最具代表性的 Wnt3a 细胞因子，在机体内分布广泛，在调控细胞更新、增殖、分化与运动等方面至关重要，是类器官培养最常用的细胞因子之一。

② EGF 是目前发现的 EGFR 的主要配体之一。由于 EGF 配体与细胞外受体（例如 EGF）相结合，EGFR 二聚体化引起胞内域形成酪氨酸激酶活化，激活下游信号通路，经信号的级联反应，最终信号传递至细胞核，调控相应基因的表达，进而控制细胞生长分裂、分化、迁移与粘附等生理活动。EGF 是胃肠道、甲状腺、肝脏、脑等多种类器官培养所需的细胞因子。

③ R-Spondin 家族是近年来发现的一种重要的 Wnt 激活剂，其家族由 4 个成员，即 R-Spondin-1 、R-Spondin-2 、R-Spondin-3 和 R-Spondin-4 组成。Wnt-R-Spondin-1 信号通路在类器官培养中特别重要。此信号通路的胞外 Wnt 配体需结合 Frizzled 和 Lrp5/6 而被活化，而细胞中的泛素化降解机制会降解 Frizzled，使得 Wnt 信号通路被抑制，R-spondin 可以抑制 Frizzled 的泛素化进而促进 Wnt 通路的活化【6】，因此在类器官培养过程中往往 Wnt-3a 和 R-Spondin 两种细胞因子需要同时添加。

④ Noggin 是骨形态发生蛋白(BMPs)的拮抗剂，在胚胎早期发育，四肢形成和神经系统发育中起重要作用，Noggin 作为 Wnt 信号通路及 BMP 信号的重要调控因子，在众多组织器官发育过程中起着重要作用。

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类器官的鉴定

由于体外干细胞诱导生成的类器官与其对应的体内组织的一致性是决定类器官质量的关键，因此，要对类器官进行鉴定。初步鉴定可使用显微镜和 H&E 染色方法观察形态，评估类器官与体内对应组织器官是否具有相似的组织学形态特征；之后可采用蛋白质免疫印迹（WB）、qPCR、ELISA、流式细胞术、IHC 等检测类器官是否表达预期的 Biomarker；类器官细胞基因情况鉴定也是必要的，通过基因测序和转录组测序可以鉴定类器官是否有某些基因缺失突变及表达谱特征；此外，对于一些类器官，可检测其是否具有预期功能，例如：肠类器官细胞 CFTR 活性功能检测、心脏类器官是否可以自主跳动等。

参考资料：

1. Annu Rev Neurosci. 2022 Jul 8;45:23-39. doi: 10.1146/annurev-neuro-111020-090812.

2. Nat Mater. 2021 Feb;20(2):145-155. doi: 10.1038/s41563-020-00804-4.

3. Biopreserv Biobank. 2020 Jun;18(3):222-227. doi: 10.1089/bio.2019.0062. Epub 2020 Apr 17.

4. Nat Rev Mater. 2021;6(5):402-420. doi: 10.1038/s41578-021-00279-y.

5. Stem Cells Int. 2019 Apr 18;2019:4508470. doi: 10.1155/2019/4508470.

6. Genes Dev. 2014 Feb 15;28(4):305-16. doi: 10.1101/gad.235473.113.

E.N.D

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