mRNA疫苗的免疫原性分析

10月2日，万众瞩目的2023年的诺贝尔生理学或医学奖，授予了匈牙利科学家卡塔林·卡里科（Katalin Karikó）和美国科学家德鲁·韦斯曼（Drew Weissman），以表彰他们在核苷碱基修饰方面的发现，这些发现使得针对新冠的有效 mRNA 疫苗得以开发。今天，我们也追赶热点，聚焦于mRNA疫苗，对其免疫原性分析进行一些讨论。

背景

2020年年初，新冠病毒爆发。为建立疫情防护屏障，人们需要尽可能快研发出安全且有效的疫苗。与传统疫苗相比，mRNA疫苗由于其研发周期短、生产相对简单的特点在这场疫苗竞赛中崭露头角。目前国内外已经有多个mRNA疫苗正式获批上市，包括BioNTech与辉瑞共同研发的BNT162b2（商品名COMIRNATY）、Moderna公司研发的mRNA-1273（SPIKEVAX）以及石药集团研发的SYS6006等。

除了新冠防护外，人们开始延伸mRNA疫苗的应用场景，如辉瑞正在扩大传染病领域的科学创新，Moderna的mRNA疫苗在癌症和传染病方面也取得了积极的临床结果。国内的若干家mRNA疫苗研发技术公司，也聚焦于传染病与肿瘤领域。本文讨论mRNA疫苗的作用机理的中心：免疫原性及其生物分析。

· 作用机理

mRNA疫苗的核心作用机理是将mRNA序列导入到宿主细胞的细胞质，利用宿主细胞将mRNA翻译为蛋白抗原，最终介导机体产生抗原特异性免疫应答，并形成免疫记忆。在抗原特异性免疫应答过程中，B淋巴细胞特异性活化，产生抗原特异性抗体，介导体液免疫应答。辅助T细胞（CD4+）以及杀伤性T细胞（CD8+）活化，分泌细胞因子，活化B淋巴细胞，发挥细胞毒作用，介导细胞免疫应答。相较于传统的灭活疫苗或者亚单位疫苗，mRNA编码的抗原可以在机体内较为持久地产生，介导较为持续且强烈的免疫应答，具有明显的免疫保护力优势。

图1 mRNA疫苗作用机理

· 递送方法

mRNA分子量比较大，具有亲水性，工业化制备流程简单。但是mRNA本身不太稳定，且自身呈现负电荷性质，因此其体内稳定存在且成功转移至细胞质是mRNA疫苗开发技术的关键。为了避免mRNA在进入细胞质前被降解及进入细胞质后被胞内溶酶体降解，目前主要采用脂质纳米粒（Lipid nanoparticle，LNP）作为载体来介导mRNA的递送。LNP主要由阳离子磷脂、辅助磷脂、胆固醇及PEG化磷脂组成。LNP包裹着mRNA，能够提高其稳定性，并且能够与细胞膜进行融合，进而促进mRNA内化成核内体（endosome），然后核内体酸化降解，mRNA释放至细胞质。随着BioNTech等公司研发的mRNA-LNP疫苗的上市，LNP递送技术也迎来发展的辉煌时期。虽然现在LNP技术专利掌握在少数几个公司（例如Arbutus），但是随着更多厂商投入到LNP的研发，以后有望突破技术壁垒，激发mRNA-LNP更大的潜力。

mRNA疫苗的免疫原性简介

mRNA疫苗通常由LNP包裹mRNA组成，因此它的免疫原性来源于三个方面：mRNA序列本身、递送载体LNP以及mRNA的翻译产物。

外源的mRNA具有一定的免疫原性问题，能够通过TLRs引发机体产生固有免疫应答，介导炎症反应的产生，表现为多种诸如TNF-α、IFN-γ等炎症因子水平的升高。通过对mRNA序列进行序列优化改造，选择人源性的同义密码子，优化非转译区（UTR）结构，引入5’帽结构和3’端多聚A尾序列，能够有效降低mRNA免疫原性。

如前所述，LNP主要由阳离子磷脂、辅助磷脂、胆固醇及PEG化磷脂组成。脂质引起机体免疫原性的风险比较低，但PEG成分的存在，介导机体产生抗PEG抗体，从而加速载体在体内的快速清除，改变mRNA疫苗的体内分布和生物利用度，影响产品的安全性和有效性。如果患者体内预先存在高水平抗PEG抗体，则给药PEG修饰载体后可能引发危及生命的过敏反应。因此检测患者体内PEG抗体的水平有助于mRNA疫苗的安全性和有效性评估，并对给药后过敏反应进行有效地控制。

mRNA进入到细胞质后，特异性表达为蛋白抗原。蛋白抗原具有高免疫原性，激活机体体液免疫应答以及细胞免疫应答。体液免疫应答方面，表现为B淋巴细胞活化，产生抗原特异性抗体（IgG），通过结合抗原，发挥预防传染性疾病的作用。细胞免疫应答方面，表现为CD4+/CD8+ T淋巴细胞活化，杀伤呈递有抗原肽的肿瘤细胞，起到靶向肿瘤治疗作用。mRNA表达产物免疫原性的强弱、其介导产生抗体水平的高低以及抗原特异性T细胞的活化程度决定了mRNA疫苗的有效性，也是临床检测分析的重点领域。

mRNA疫苗免疫原性分析相关法规或指南

国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布的相关指导原则有：

《肿瘤主动免疫治疗产品临床试验技术指导原则（试行）》，2023；

《新型冠状病毒预防用疫苗非临床有效性研究与评价技术要点（试行）》，2020；

《药物免疫原性研究技术指导原则》，2021。

FDA发布的相关指导原则有：

Guidance for Industry-ClinicalConsiderations for Therapeutic Cancer Vaccines，2011；

Guidance for Industry-Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID-19，2020。

mRNA疫苗的免疫原性分析策略

在注册临床试验中，mRNA疫苗的免疫原性分析，主要聚焦于表达产物（抗原）引起的体液免疫应答以及细胞免疫应答检测。体液免疫应答检测内容主要为血清中产生的抗原特异性结合抗体以及中和抗体（NAb）水平的检测。细胞免疫应答检测主要为细胞免疫表型检测以及胞内细胞因子的检测。在mRNA新冠疫苗的临床研究中，除上述体液和细胞免疫应答检测，也进行了血清中的炎症细胞因子的检测以及抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）/抗体依赖性中性粒细胞吞噬（ADNP）/抗体依赖性补体沉积（ADCD）等。下文中我们着重介绍注册临床中的mRNA疫苗的免疫原性分析。

表1 COVID-19 mRNA 疫苗免疫学分析

· 结合抗体（IgG）检测策略：

针对抗原特异性结合抗体检测，可以采用超敏电化学发光（MSD）或者酶联免疫反应（ELISA）方法。MSD 方法原理示意图如图2所示。将抗原肽包被在96孔板，之后反应孔中分别加入血清样本以及侦测抗体（例如Ru标记抗IgG抗体），形成“抗原肽 - 抗体（IgG） -侦测抗体”复合物。反应孔中加入底物后，通过检测化学发光信号值评估血清样本中抗原特异性抗体水平。

图2 MSD方法示意图

基于MSD方法，分析mRNA-1273以BNT-162b2介导机体产生结合抗体的水平检测结果（参见图3A）发现，接种单剂量mRNA疫苗后，个体体内产生了与新冠患者康复期体内相当的结合抗体水平，且远远高于未感染的个体。另外，接种双剂量mRNA疫苗后，个体体内产生远高于康复期患者的结合抗体水平。mRNA-1273以及 BNT-162b2在机体内均表现出较高的免疫原性以及有效性，尤其是mRNA-1273的免疫刺激强度更高。

图3 mRNA-1273以及BNT-162b2免疫原性

A. 结合抗体测定   B. 中和抗体滴度测定

·NAb检测策略：

对于mRNA疫苗，尤其是预防性疫苗（例如新冠mRNA疫苗），体液免疫应答检测也会涉及NAb的检测。新冠mRNA疫苗介导产生的NAb，能够直接与新冠病毒的刺突蛋白发生特异性结合，抑制其与细胞表面的ACE2受体结合，从而保护机体免受新冠病毒的感染。NAb滴度水平同样也是新冠mRNA疫苗免疫原性以及有效性检测的重要指标。以新冠mRNA疫苗为例，NAb检测方法主要为假病毒试验（参见图4）。以慢病毒或者逆转录病毒为载体，构建包膜表达新冠刺突蛋白、并且包装有荧光素酶和/或GFP报告基因的假病毒。该假病毒可有效感染ACE2过表达的细胞（例如293T-ACE2），介导荧光素酶的表达，荧光素酶的活性水平与感染细胞数量呈正相关。NAb检测试验中，将系列稀释的血清样本与假病毒和细胞进行共同孵育，血清中存在的中和抗体会特异性结合假病毒，抑制假病毒对细胞的转染，从而导致检测体系中荧光素酶表达量降低，最终表现出降低的荧光信号值。通过分析荧光信号值的降低程度，可以评估血清样本中NAb的滴度。

图4 假病毒中和试验

基于假病毒中和试验，mRNA-1273以及BNT162b免疫机体后产生NAb的滴度强弱结果见图3B。采用未感染的个体，建立的方法滴度临界值（pNT50）为20。在该滴度临界值条件下，90.1%的未接种疫苗的康复期个体呈现NAb阳性的结果。mRNA-1273及BNT162b单次接种未感染个体后，接种人群均表现出与康复期患者相当的几何平均滴度值。两次接种未感染个体后，接种的所有个体均呈现NAb阳性结果，且接种人群表现出较高的几何平均滴度值，展现出了良好的有效性数据。

· 细胞免疫应答检测策略：

mRNA疫苗除了激活B细胞产生抗体之外，同样可以激活T细胞，介导细胞免疫应答。活化后的抗原特异性T细胞在体内可以维持较高的水平，在肿瘤细胞杀伤方面表现出较高的效率。目前mRNA疫苗的细胞免疫应答通常采用酶联免疫斑点法（ELISpot）等方法进行检测。

ELISpot是细胞免疫学研究中比较灵敏的检测方法，可以在单个细胞水平对细胞因子分泌细胞或抗体分泌细胞进行检测，从而评估细胞免疫应答的强弱。ELISpot试验原理示意图见图5，将抗原或抗原肽库与PBMC在反应孔中进行混合培养，淋巴T细胞受到抗原刺激活化后局部产生的细胞因子（例如IFN-γ）被ELISpot板底包被的抗体特异性捕获。去除细胞后，反应孔中依次加入检测抗体、酶偶联物及反应底物，最终板底PVDF膜上面形成许多斑点。斑点数量越多表明分泌该种细胞因子的细胞数量越多。通过分析斑点的数目即可评估抗原特异性T细胞的数量以及体内所引起的T细胞免疫应答的强弱。

图5 ELISpot试验原理

ELISpot试验过程中，PBMC的生物学功能对试验结果的准确性至关重要。临床中心提取全血后到分离PBMC的时长、提取方式、冻存方式、运输条件、解冻&复苏步骤等环节均可能会影响到PBMC的活性，并进一步影响后续试验结果的评估。因此，ELISpot试验前需要规范化PBMC的处理方式，在保留较大提取收率的同时，维持其生物学活性。此外，ELISpot试验检测T细胞免疫应答另一个需要重点考虑的因素是抗原或肽段的选择。抗原/肽段的选择决定抗原特异性T细胞能否在ELISpot试验中被检测到。选择蛋白抗原，考虑到其在体内被APC的摄取及抗原肽呈递，可用于检测全部的抗原特异性CD4+ T细胞。选择肽库，考虑到其较短的肽段序列及HLA的适配性，可用于检测抗原肽特异性CD8+ T细胞和/或CD4+ T细胞。目前对于mRNA疫苗类药物，在ELISpot试验中通常选择体外合成的肽库来检测T细胞免疫应答，肽库的构成以及质量需要重点关注。

研究者基于IFN-γ ELISpot试验采用SARS-CoV-2刺突蛋白肽库检测了mRNA-1273、BNT162b以及Ad26.COV2.S三种疫苗免疫机体后的T细胞免疫应答，试验结果如图6所示，采用的临界值为10 SFU/10⁶ PBMC。几乎全部的未感染且未接种疫苗个体的PBMC在试验中呈现阴性结果，而接种mRNA-1273及BNT162b的大多数个体的PBMC在试验中均表现出较高的斑点数（平均值分别为511 SFU/10⁶ PBMC及348 SFU/10⁶ PBMC），呈现出阳性结果，表明疫苗引起了增强的抗原特异性T细胞免疫应答，且两种mRNA疫苗所引起的T细胞免疫应答强度高于Ad26.COV2.S。mRNA-1273及BNT162b均表现出了较好的有效性数据。

抗原特异性CD8+ T细胞检测试验结果发现，全部未感染且未接种疫苗个体呈现阴性结果，58%的已感染且未接种疫苗个体呈现阳性结果。mRNA-1273及BNT162b接种后，相较于已感染且未接种疫苗个体组，呈现出对刺突蛋白肽库较低的阳性应答率，但仍表现出一定强度的CD8+ T细胞免疫应答水平。

图6 mRNA-1273以及BNT-162b2的细胞免疫应答检测

A. T细胞免疫应答检测   B. CD8+ T细胞免疫应答检测

总结

相较于传统的灭活疫苗及病毒载体疫苗，mRNA疫苗有更好的有效性、更快的设计与生产过程、更灵活、更具成本效益。随着越来越多的mRNA疫苗进入到临床治疗领域，其安全性、有效性、免疫原性评估需要更加重视。对于mRNA疫苗免疫原性的检测，除了体液免疫应答，细胞免疫应答也需要重点考察，从而有助于解读分析临床有效性以及不良反应数据。预测不久的将来，mRNA疫苗能够更好地服务于临床，成为疾病治疗领域的一把利器。

E.N.D

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