【文献解读】Genome Biology：人类微生物组研究中的DNA提取：标准化问题

                简介                 

标题：Genome Biology：人类微生物组研究中的DNA提取：标准化问题

杂志：Genome Biology

影响因子：10.806

发表时间：2019年10月21日

解读：很跩的土豆

编辑：很跩的土豆

导读：在人类微生物组研究中，包含实验获取测序样本到生物信息学分析的多种处理流程。然而，DNA的提取的方法学的不同可能造成分析数据的差异甚至可能获得错误的分析结果。本文列举了DNA提取流程中一些关键问题，提出了提取过程中的最小需求，以尽可能提高方法的可重复性。以尽可能提高方法的可重复性。

                正文                 

1.     引言

微生物组学分析流程的标准化是获取可靠的人类微生物组检测结果的基础。分析结果的多变性可能源于分析流程中的多个步骤，包括样本采集、DNA提取、测序和生物信息学分析。在这些因素中，微生物组质量控制计划（MicroBiome Quality Control project, MBQC）[1]、国际人类微生物组标准化组织（International Human Microbiome Standards group, IHMS）[2]等均提出DNA提取是造成分析结果多变性的最主要因素。因此，尽管其他因素也有对结果多样性有着不同程度的影响，但是本文主要探讨不同人类样本类型的DNA提取问题，同时总结一些人类微生物组研究过程中适合的参考材料。

2. 粪便样本的DNA提取

目前，有很多关于人类样本微生物组DNA的提取流程，其中绝大部分都是关于粪便微生物组的DNA提取。人类微生物组计划（Human Microbiome Project，HMP）[3]、MetaHIT [4]、地球微生物组计划（Earth Microbiome Project）[5]以及很多课题组都发表过粪便和其他样本的DNA提取的流程。

       MBQC和IHMS评估了不同方法对于粪便样本DNA的提取，结果发现提取流程的不同对于结果的多样性影响极大[1,2]。不同DNA提取方法间结果的多变性主要来源于以下因素：试剂污染、细胞裂解的类型（比如机械裂解或酶裂解）、DNA提取过程中实验人员的差异和自动化水平的高低等等。IHMS在报道中还提出了一个容易使用和可重复性高的DNA提取方法[2]，尽管目前该方法已经很少被使用。另一项研究直接比较HMP和MetaHIT粪便样本提取方法，发现MetaHIT的DNA提取流程能够获取更多映射到真核生物基因组的reads，而HMP流程可获取更多映射到细菌基因组的reads。即使在细菌的分析中，两种方法在种水平的分析结果均有较大差异[6]。这些研究表明，使用一个标准化的DNA提取流程可能降低因DNA提取造成的结果可变性，但是仍然不能避免实验过程中的提取差异。尽管目前存在多种可能的标准流程，但是只选择一个标准化流程以适用于所有研究仍然十分困难。比如，大样本处理过程中的自动化需求和对样本中微生物的真实组成的未知等均可能造成分析结果的差异。对照样本的使用可能有助于解决这些问题，但是还需要更多的研究评价这些DNA提取流程。

       然而，还有一些标准化流程被提出，这些方法并非总是适用于其他一些人类样本的DNA提取。比如，与粪便样本相比，人类口腔样本中含有更高的宿主DNA[7,8]，这可能影响DNA提取的质量和下游的分析流程。也有一些方法用于去宿主[9]，但是这些方法大同小异且可能造成DNA提取和细菌群落的偏好性。总的来说，尽管粪便样本的DNA提取流程被研究较多，但还需要更多的研究以提高提取方法在其他各种样本中的适用性，尤其是非粪便样本和低生物量的样本。

3. 低生物量样本的DNA提取

已经有多项研究关注了低微生物量样本，如人类组织样本、脊柱和关节液等。高微生物量的样本（如粪便样本）很少因为处理流程中的样本污染造成分析结果的偏好性和假阳性，然而低微生物量的样本极容易受到外源性污染的影响[10,11]。有两种方法能够避免大多数（并非全部）错误分析结果：（1）降低可能的污染；（2）使用测序分析以外的其他方法证明微生物的存在。

       对于低微生物量样本的相关污染，已有多项研究阐述了DNA提取试剂盒和其他试剂引起的污染[11,12]；然而，除了这些污染以外，研究者还必须尽可能地避免样本采集和处理过程中的所有污染。比如，肿瘤相关微生物组研究使用的肺组织等低微生物量样本，可能从采样伊始就含有大量的样本污染且需要尽量减低相关污染。在这些造成污染的场景中，采样位置是引起污染的开始；此外，空气、手术器械、手套、采集管、患者皮肤和其他样本均可能成为污染来源，在获取检测样本后，应当立即冻存。此外，在一个污染来源越少越好的环境中采集样本也会使得结果更加理想，比如将无菌套件传递至手术间可能优化微生物组的分析结果。在DNA提取过程中，使用低微生物量样本特定的DNA提取方法[13,14]，以及使用一个微生物组学研究指南中的检查单可能降低或者鉴定出污染来源[10]。

       为了检测低微生物量样本中的微生物组成，尤其是检测那些曾经被认为“无菌”的样本时，使用微生物培养或者原位荧光杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）等方法是被认可的。然而，对于某些有偏好的微生物（如厌氧菌）可能无法在采样环境中存活，通过使用RNA探针进行FISH或者特定微生物培养（如Fusobacterium）可以提高活体微生物或者多种微生物存在的证据质量。

4. 非细菌微生物的DNA提取

大多数的DNA提取流程都被用于粪便样本的16S rRNA或宏基因组测序。由于粪便样本中的微生物群落主要是由细菌菌群组成[4]，大多数DNA提取流程都用于优化细菌基因组的获取，这可能造成真菌、原生生物和病毒DNA提取量的降低。某些研究报道了提高真菌菌群DNA提取的方法[17,18]，但是还需要大样本、多中心的研究用于评估这些人类真菌菌群DNA提取的方法。对于病毒DNA的提取，已经有相关流程用于富集病毒粒子并去除来自人或微生物细胞的污染[19]。然而，这些方法都只是关注病毒，而去除掉了其他微生物。这表明还需要开发一种病毒DNA提取方法以弥补其他微生物DNA的缺失，或者开发一种适用于所有微生物DNA提取的方法。

5. DNA提取过程中使用质量控制样本

由于缺少人类微生物组研究的标准参考材料，因此微生物数据库中通常没有质量控制样本，这导致比较结果的可重复性不太可能[20,21]。质量控制样本能够用来比较不同DNA提取方法的差异。目前，微生物组分析中可以使用三种阳性参考材料：（1）复杂环境样本（如供体粪便）[1,22]；（2）体外培养的微生物模型系统中的恒化培养群落（chemostat communities）[1,23]；（3）人工或模拟微生物群落（artificial or mock communities）。每种参考材料都有自己的优点和缺点。复杂环境样本的优点在于它尽可能的接近了待测样本的微生物组成，这对于菌群种类及其丰度的分析尤其重要。然而，这种微生物的生态系统由很多低丰度菌群组成，当在其他研究中需要更多参考材料时很难再现。恒化培养群落的优势在于它接近复杂环境样本并且能够产生大量参考材料；然而，其供应依然有限，因为不同批次的恒化培养体系可能无法完全重复以至于某些群落可能在某个批次中缺失。纯化的微生物菌株和模拟微生物群落由已知数量的不同细菌组成，但是它缺少环境样本的复杂性，并非来自同一种微生物环境基质，且只包含可培养的微生物。复杂环境样本和恒化培养群落能够用于评估DNA提取的可重复性和一致性，而人工或模拟微生物群落能够作为已知群落对分析的准确性进行评估。然而，没有一种参考材料是完全理想的，目前可以使用这些参考材料对研究内或研究间进行标准化。

       除了阳性对照外，用于低生物量样本参考的阴性对照也同样重要[1,20]。每种试剂盒以及被用于样本处理的实验室试剂中的空白对照对于鉴定潜在的污染也相当关键。最起码，空白样本和背景环境污染对照样本需要在整个分析流程中被处理和分析。然而，这也很难去除掉所有污染，鉴定和定量污染物对于在研究中获取准确的结果或者比较研究间的结果都非常重要。即使是在不同使用者、不同DNA提取批次、不用研究和不同实验室，阳性对照和阴性对照的使用都能够促进标准化的形成。

6. 总结和展望

在理想条件下的人类微生物组研究中，我们希望提取一个样本中所有或者特定的微生物DNA，以满足对该样本中微生物特点进行准确分析的需求。然而，由于缺乏对于复杂样本真实组成的认识，我们还不太可能保证DNA提取方法的有效性，但是我们至少需要尽可能地保证结果的一致性和可靠性。大量的研究在探索多种样本类型最佳的DNA提取方法，尤其是粪便样本，但是还需要更多其他样本和非细菌微生物样本的DNA提取的优化方案。同时，我们在本文建议了至少三种最小的标准化方案：（1）详细报告DNA提取方法，提高其他实验室对于该流程的可重复性；（2）在DNA提取的全流程中，使用阳性对照和阴性对照，以评估结果的准确性和去除可能的污染；（3）对于不同部位样本和不同机构的研究都使用相关的DNA提取流程，测序结果形成一个数据集。各种期刊有责任确保各项研究在发表前满足前述的最小标准，正如其他期刊报告的标准指南一样（如《CELL》杂志发表的STAR分析流程）。对于人类微生物组研究，或许永不会有一个标准流程；但是科研工作者、审稿人和杂志编辑应当致力于优化现有流程、发表一定的准则以提高不同实验室和不同研究间结果的可靠性和一致性。

                参考                 

本文：Greathouse et al. Genome Biology (2019) 20:212. https://doi.org/10.1186/s13059-019-1843-8
文中：

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                索引                 

【往期文献】

GUT: 新冠病毒病毒活性与COVID-19患者肠道菌群的关系

Microbiome: 化学法去除宿主DNA以提高唾液样本宏基因组测序质量（唾液样本）

                后记                 

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