3分的LncRNA研究文章怎么做？只做CRISPR实验就够了

今天解读一篇Almost只做CRISPR实验的3分LncRNA文章，深圳大学一附院的研究人员发表在J Cancer杂志的题为 LncRNA-MALAT1 Inhibits Apoptosis and Promotes Invasion by Antagonizing miR-125b in Bladder Cancer Cells的文章（图1）。回复关键词：MALAT1，获取该文章。

图1

摘要：越来越多的证据表明，LncRNAs在不同的癌症发展中发挥重要作用。明星分子LncRNA-MALAT1之前被认为是膀胱癌中miR-125b的直接靶向目标，促进癌症的进展与侵袭。其实，MALAT1也可以靶向miR-125b。

在本研究中，利用 qRT-PCR和CRISPR技术，证实MALAT1能够抑制成熟miR-125b和增加其靶基因（Bcl-2和MMP-13）的表达，但对pri-miR-125b和pre-miR-125b无影响。

我们观察到的生物素标记的MALAT1 RNA探针能够拉下Ago2和miR-125b，MALAT1 对miR-125b的负调控作用是依赖于Ago2。

MALAT1调控癌症发展在一定程度上是由于miR-125b和它的两个靶基因激活的特异性抑制。

以上数据表明，“MALAT1-miR-125b-Bcl-2 / MMP-13”信号轴在膀胱癌的进展中发挥重要作用，从而可以为人类提供膀胱癌的潜在治疗策略。

Introduction

膀胱尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，且预后较差。膀胱癌的发生发展过程中可能存在一个涉及原癌基因激活和抑癌基因失活的多步骤过程。许多ncRNAs的表达变化导致下游基因通路的异常活动，在该疾病中起关键作用。LncRNAs是一种转录长度大于200nt的RNA分子，它们不编码蛋白质，但通过表观遗传和转录后基因表达调控机制起重要作用。虽然现在对于LncRNAs的致癌机制，但是已经发现了很多在膀胱癌中异常表达的LncRNAs，包括UCA1、HOTAIR、TINCR等。膀胱癌中的LncRNAs的生物学功能很大程度上是未知的。MALAT1是在许多癌症中表达上调，如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和肝癌等。以往研究表明，MALAT1抑制膀胱癌肿瘤细胞凋亡和促进细胞的侵袭，然而MALAT1通过调控基因表达对肿瘤影响的机制目前还不清楚。

另一种ncRNA，miRNAs也被发现在肿瘤中起着相似的作用。大量证据表明miRNAs的异常表达通过调控下游靶基因mRNA水平，在调节肿瘤细胞的生物学行为中起着关键作用。例如，miR-125b在包括白血病、结直肠癌、膀胱癌和肺癌在内的多种肿瘤中表达上调。之前的研究表明miR-125b可以抑制癌细胞增殖，以及通过抑制抗凋亡蛋白（Bcl-2、MMP13）表达来促进细胞凋亡。miR-125b通过下调MALAT1的表达在膀胱癌中作为抑癌基因，MALAT1是miR-125b的直接靶向目标。

最近的一些研究表明，miRNAs可以降解LncRNAs，同时，LncRNAs也可以抑制miRNA的表达。miR-125b可能通过RNA诱导沉默复合体（RISC）对MALAT1进行负调控，表明miR-125b和MALAT1之间可能存在相互抑制的反馈回路。我们猜测在膀胱癌中MALAT1作为miR-125b的分子海绵来抑制其表达，这在一定程度上解释了MALAT1调控肿瘤的进展。

介绍部分写的不少，我提炼一下，膀胱癌中有许多异常表达的LncRNAs；MALAT1抑制膀胱癌肿瘤细胞凋亡和促进细胞的侵袭；miR-125b可以抑制癌细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡；miR-125b通过直接靶向MALAT1，从而下调其表达；miR-125b和MALAT1之间可能存在相互抑制的反馈回路。

Results

MALAT1 负调控miR-125b表达

为了确定MALAT1可以抑制miR-125b的表达，作者使用了新开发的技术CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPRi）分别上调和下调表达MALAT1的表达，该CRISPR技术相比RNAi具有更高的稳定性和更低的脱靶效应。通过sgRNA1-3将dCas9-VP64蛋白靶向MALAT1的启动子区域来激活其表达。其中sgRNA3效果最好（图2A）。通过通过sgRNA4-6将dCas9蛋白靶向MALAT1来抑制其表达，其中sgRNA6效果最好（图2B）。

图2

dCas9-VP64和sgRNA-3进入T24细胞激活MALAT1表达后，成熟miR-125b表达降低，但pri-miR-125b和pre-miR-125b几乎无变化（图3A）；dCas9和sgRNA-6进入T24细胞抑制MALAT1表达后，成熟miR-125b表达升高，但pri-miR-125b和pre-miR-125b几乎无变化（图3B）。说明可能是转录后水平的调控作用，前期研究发现MALAT1包含成熟miR-125b的两个直接结合位点。以上结果表明，膀胱癌中MALAT1可能作为miR-125b的分子海绵来抑制其表达。

图3

MALAT1影响内源性miR-125b靶基因的表达

为了确定MALAT1影响内源性miR-125b靶点的表达，分析了MALAT1对miR-125b的两个众所周知的靶基因Bcl-2和MMP-13表达水平的影响。CRISPR实验和Western blot检测结果表明，MALAT1抑制内源性miR-125b表达，促进Bcl-2和MMP13的蛋白表达（图4）。

图4

AGO2是AGO家族中唯一在RNA沉默过程具有催化活性的诱导沉默复合体（RISC），AGO2已被证实通过miRNA依赖或独立的途径参与肿瘤的发生，由于MALAT1调控miR-125b表达可能通过转录后机制，推断MALAT1可能通过Ago2复合物来降低miR-125b表达。通过RNA pull down实验和Western blot检测，发现MALAT1与Ago2相互作用（图5A），也发现了MALAT1 pull down沉淀中有大量miR-125b。

为进一步确定是否MALAT1通过Ago2介导的RNAi通路来下调miR-125b，我们用Ago2 siRNA下调Ago2蛋白的表达（图5B）。

Ago2 siRNA存在时，MALAT1对miR-125b的下调作用明显消除（图5C）。所有这些数据表明，MALAT1可以作为天然miRNA海绵和降低miR-125b的表达通过Ago2介导转录后调节机制。

图5

miR-125b抑制剂能部分逆转因CRISPRi-MALAT1引起的细胞凋亡

CRISPRi增加细胞凋亡率（图6A），使用miRNA抑制剂抑制miR-125b后，发现CRISPRi引起的T24细胞凋亡被部分逆转。Bcl-2 siRNA能进一步逆转CRISPRi引起的T24细胞凋亡（图6A和B），表明在T24细胞中可能存在一个“MALAT1-miR-125b-Bcl-2 ”信号轴。

图6

miR-125b抑制剂能部分逆转因CRISPRi-MALAT1引起的细胞运动能力的改变

CRISPRi降低T24细胞侵袭能力（图7A），使用miRNA抑制剂抑制miR-125b后，发现CRISPRi引起的T24细胞侵袭抑制被部分逆转，MMP13 siRNA能进一步逆转CRISPRi引起的T24细胞下降的侵袭能力（图7A和B），表明在T24细胞中可能存在一个“MALAT1-miR-125b-MMP-13 ”信号轴。

图7

以上结果表明，MALAT1 作为miR-125b海绵，在膀胱癌中调节Bcl-2和MMP-13表达，从而抑制细胞凋亡和促进细胞侵袭（图8）

图8

到这里这篇文章的实验就做完了，后面的讨论就不再赘述了。这篇文章通过CRISPR来做MALAT1的过表达和干扰，其实主要还是因为MALAT1基因长达8779bp，做过表达的话常用的病毒载体容纳不了这个长度，这个长度做RNAi脱靶率也会比较高，所以选择了CRISPR技术来做，算是比较新的技术，发文章也相对容易些。

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