人类的肾脏是由上百万个肾单元以及与其相连的呈树枝状的收集管网络组成。这些肾单元过滤血液形成原尿（人体每天大约有1500升血液通过肾脏），然后原尿再经由收集管网络重吸收调控身体的水、电解质、以及酸碱pH值的动态平衡，最终形成的尿液存储于膀胱并最终排出体外。肾脏在维持哺乳动物机体稳态中扮演中心的角色。在肾脏胚胎发育过程中，肾单元祖细胞（nephron progenitor cell，NPC）能够自我更新并产生新的肾单元。然而，NPC只存在于胚胎发育期的肾脏，在出生后NPC就消失了。因此，肾脏在损伤后的自我修复能力非常有限。当肾脏的损伤达到一定的程度就会导致终末期肾病（肾衰竭）。肾衰竭的病人需要进行肾透析才能存活，然而此方法医疗费用昂贵且未能根治终末期肾病。治疗肾衰竭的另一策略是肾移植，此方法可很好地根治终末期肾病，然可移植的肾源极其有限。在器官移植手术中，超过80%的器官衰竭的病人需要更换的器官是肾脏。如何培育出可替代肾源已成为肾脏再生领域的“瓶颈”问题。近年来，通过干细胞体外培养产生的具有三维结构的微型肾脏模型，即“肾脏类器官”，为肾脏发育、肾脏疾病致病机理研究以及肾脏再生提供了强大的工具。目前人多能干细胞诱导分化成的肾单元类器官（nephron organoid）包含一些类似肾单元的结构，然而这些类器官包含大量的脱靶细胞亚群，形成的肾单元也不够成熟，类似于胚胎早期的没有功能的肾单元。这些问题可能是因为在肾单元类器官形成过程中从人类多能干细胞诱导的肾单元祖细胞自身的缺陷。此外，目前人多能干细胞来源的肾单元祖细胞不能在体外进行长期扩增培养，这极大地限制了这类细胞在未来的广泛应用，例如为人工合成肾脏和肾脏再生提供干细胞资源。2024年4月30日，美国南加州大学凯克医学院博德干细胞研究所李中伟团队在 Cell Stem Cell 期刊发表了题为：Long-term expandable mouse and human-induced nephron progenitor cells enable kidney organoid maturation and modeling of plasticity and disease 的研究论文。该论文首次报道了一个全新的二维培养方法，通过小分子化合物调控p38和YAP信号通路，实现长期体外扩增培养原代小鼠肾单元祖细胞、人原代肾单元祖细胞及人多能干细胞来源的诱导型肾单元祖细胞。这一肾单元祖细胞体外扩增培养系统进一步揭示了足状突细胞（podocyte）的可塑性。基于扩增的肾单元祖细胞进行的全基因组CRISPR筛选，找到了新的肾脏发育与疾病相关基因。扩增后的诱导型肾单元祖细胞跟体内的人类肾单元祖细胞更加相似。这些细胞能够自发分化为高纯度的新型肾单元类器官。这些肾单元类器官含有极少的脱靶细胞，且诱导分化出成熟表征的足状突细胞。此外，基于扩增的肾单元祖细胞构建的多囊性肾病微型类器官能够用于药物筛选，找到了一个潜在的治疗囊性肾病的小分子。诱导型肾单元祖细胞的长期体外扩增培养为进一步的人工合成肾脏提供重要的干细胞资源。李中伟博士在2016年首次报道了利用三维培养体系扩增肾单元祖细胞的方法。然而，肾单元祖细胞的三维培养体系高度依赖细胞间的相互作用，不能形成单细胞克隆，这极大地限制了这些扩增的肾单元祖细胞的应用，比如进行全基因组CRISPR筛选。此外，人多能干细胞来源的诱导型肾单元祖细胞能够为体外研究人肾单元祖细胞及未来人工合成肾脏提供了极其重要的干细胞资源，且能够为个体化精准治疗提供可能，然而，至今尚未发展出体外长期扩增培养诱导型肾元祖细胞的细胞培养体系。围绕以上肾脏再生领域的瓶颈问题，该团队尝试利用小分子化合物构建对肾单元祖细胞长期体外扩增培养的二维培养体系。基于肾单元祖细胞三维培养体系，通过微调WNT信号通路，以及对p38信号通路进行抑制，该团队成功研发出能够支持小鼠肾单元祖细胞体外二维扩增培养的细胞培养体系。该培养体系能够帮助构建原代小鼠肾单元祖细胞系，不限小鼠遗传背景，不依赖细胞分选纯化，甚至能够从整个小鼠胚胎肾脏或单个肾单元祖细胞构建肾单元祖细胞系。该培养体系能够支持小鼠肾单元祖细胞快速高纯度体外扩增至少1个月，扩增~1014-1017倍，转录组分析揭示扩增的肾单元祖细胞高度相似E11.5-E13.5原代小鼠肾元祖细胞，并且扩增的肾单元祖细胞展示强大的肾单元发生能力（nephrogenic potential），形成肾单元类器官。在此基础上，该团队发现，利用小分子化合物TRULI激活YAP信号通路，能够在体外长期扩增培养人的肾单元祖细胞。该培养体系不仅能构建原代人肾单元祖细胞系，更重要的是，这一培养体系也支持人多能干细胞来源的诱导型肾单元祖细胞的长期体外扩增培养。该培养体系能够支持人肾单元祖细胞体外快速高纯度扩增至少3个月，且转录组分析揭示扩增后的人肾单元祖细胞高度相似原代人肾单元祖细胞。培养的诱导型肾单元祖细胞能够形成单细胞克隆，直接有效的进行CRISPR 介导的基因编辑，这极大地促进了这些扩增的诱导型肾单元祖细胞的广泛应用。图A: 小鼠肾单元祖细胞系构建及其各种功能性应用；图B: 人多能干细胞来源的诱导性肾单元祖细胞系构建及其各种功能性应用该团队进一步以扩增的诱导型肾单元祖细胞为基础，成功构建出高纯度的新型肾单元类器官。相比于已报道的肾脏类器官，扩增的诱导型肾元祖细胞来源的肾单元类器官有3个显著的特征：1）含极其少的脱靶细胞；2）诱导产生成熟的足状突细胞；3）未有残留的未分化的肾单元祖细胞。该类新型肾单元类器官的这些优势特征使得体外研究某些肾脏疾病病理机理成为可能，例如鉴于类器官中存在的成熟的足状突细胞，可以模拟构建艾波特综合症（Alport syndrome）疾病类器官模型，探究其病理发生机制及药物筛选；该类器官所具有的高纯度特征可用以探究细胞特异性病变所引起的肾脏疾病，而规避脱靶细胞所带来的影响。扩增的诱导型肾元祖细胞来源的肾单元类器官形态(图A)；荧光染色， 蓝色结构为足状突细胞，绿色结构为前端小管，红色结构为远端小管(图B)；及单细胞测序(图C)有趣的是，该团队揭示肾单元祖细胞体外扩增培养体系能够重编程分化的肾脏细胞成肾元祖细胞样细胞（reprogrammed nephron progenitor cell，rNPC）。小鼠肾单元祖细胞体外扩增培养体系能够重塑Wnt4+细胞成肾单元祖细胞样细胞，而人肾单元祖细胞体外扩增培养体系能够重编程类器官来源的足状突细胞或原代胚胎足状突细胞成肾单元祖细胞样细胞。转录组测序分析展示这些肾单元祖细胞样细胞高度相似扩增的诱导型肾元祖细胞和原代肾元祖细胞，并且展示强大的肾单元发生能力，形成肾单元类器官。鉴于该肾单元祖细胞体外扩增培养体系支持二维培养，该团队成功地对扩增的小鼠肾单元祖细胞进行全基因组CRISPR筛选，揭示肾单元祖细胞自我更新，肾脏发育和疾病发生相关基因群，例如先天性肾脏和尿路畸形（CAKUT）或维尔姆斯氏瘤（Wilms tumor）相关基因群。同时，亦揭示表观调控蛋白KMT2A和KAT6A在肾单元祖细胞自我更新中扮演着重要的角色。此外，该团队成功构建出PKD2敲除的肾单元祖细胞细胞系，并利用这些扩增的肾元祖细胞构建多囊性肾病类器官模型。扩增的肾单元祖细胞来源的多囊性肾病类器官在分子水平，代谢水平及病理表型上很好地重塑了多囊性肾病病变过程，其囊泡形成（Cyst formation）率接近100%，而在野生型肾元祖细胞来源的类器官中却很少有囊泡形成。结合迷你微孔板（Aggrewell）的使用，该团队成功地产生成千上万个微型多囊性肾病类器官用于高通量的药物筛选，并筛选出小分子化合物PTC-209显著地抑制囊泡形成和生长。1、大量扩增的诱导型肾单元祖细胞为人工肾合成提供了重要的干细胞资源；2、全基因组CRISPR筛选对揭示由肾单元祖细胞自我更新异常引发的肾脏疾病病理机制提供关键的线索，解决了无法体外研究人肾单元祖细胞发育的“瓶颈”问题；3、以扩增的诱导型肾单元祖细胞构建的高纯度肾脏疾病类器官模型，对揭示人类肾脏疾病病理发生机制及大范围药物筛选提供了重要的平台，使体外系统性研究人肾脏疾病成为可能。南加州大学凯克医学院博德干细胞研究所副研究员黄标博士（biao.huang@med.usc.edu）和博士后曾资鹏博士为该论文共同第一作者。南加州大学凯克医学院博德干细胞研究所李中伟教授（zhongwei.li@med.usc.edu）为该论文通讯作者。南加州大学李中伟实验室专注肾脏发育、疾病与再生研究，利用人类干细胞和类器官模型，小鼠模型，基因编辑技术，结合单细胞组学、功能基因组学研究肾脏的发育机制，建立肾脏的疾病模型并进行药物筛选。实验室的长远目标是利用干细胞和工程技术在体外合成可移植的肾脏。欢迎对相关方向感兴趣的研究生、博士后以及访问学者加入本实验室 (http://lilab.usc.edu)。https://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(24)00129-2
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