Nature重磅：先导编辑发明5年后，张锋等人终于阐明了其空间结构和分子机制

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

众所周知，在CRISPR-Cas9系统中，Cas9酶在sgRNA的引导下靶向并切割目标DNA双链，导致DNA双链断裂（DSB），从而实现基因编辑，基于CRISPR-Cas9的方法已被广泛用于对各种生物的基因编辑，还被FDA批准用于治疗人类的镰状细胞病和β-地中海贫血。

2019年10月，基因编辑技术先驱刘如谦教授开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑（Prime Editing，PE），它可以在基因组特定位点实现碱基替换、小片段的插入或删除，而无需DNA双链断裂（DSB）或供体DNA模板，理论上可以修复已知的近90%的人类致病基因突变。 短短几年时间，先导编辑技术已经得到了广泛应用，并于近日获得美国FDA批准开展人体临床试验，用于治疗慢性肉芽肿病（CGD）。

先导编辑系统由来自化脓链球菌的Cas9切口酶（nSpCas9）和经过基因工程改造的氏鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT）融合而成先导编辑器在pegRNA指导下实现精确的基因编辑。然而，由于缺乏结构信息，pegRNA指导的先导编辑器的逆转录分子机制尚未得到充分理解。

2024年5月29日，东京大学濡木理（Osamu Nureki）教授团队、博得研究所张锋教授团队合作，在 Nature 期刊发表了题为：Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by a prime editor 的研究论文。

先导编辑系统由两部分组成——一个由来自化脓链球菌的Cas9切口酶（nSpCas9）和经过基因工程改造的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT）融合的先导编辑器，以及一个带有sgRNA区域和3'延伸区域的先导编辑向导RNA（pegRNA）。

sgRNA区域包含一个用于靶向目标序列特定位点的引导序列和一个与SpCas9相互作用的支架，而3'延伸区域包括一个逆转录模板（RTT）和一个引物结合位点（PBS）。PBS包含与非靶向链（NTS）3'端互补的10-15个nt序列，而RTT编码所需编辑的序列。

在先导编辑过程中，nSpCas9识别与sgRNA引导序列互补的双链DNA靶标，并在NTS上进行单链切割。然后，M-MLV RT与PBS-NTS杂合双链结合，并逆转录RTT序列，然后将所需的编辑整合到靶位点，实现所需的基因编辑。

然而，由于缺乏结构信息，目前我们对于先导编辑器如何识别PBS-NTS杂合双链以启动和终止RTT序列的逆转录过程的机制了解甚少。

为了解决这一问题，研究团队确定了先导编辑器在多种状态下的冷冻电镜（cryo-EM）结构，为理解这一新型基因组编辑系统提供了结构框架。

该研究报告了多种状态下的冷冻电镜结构，包括SpCas9-M-MLV RTΔRNaseH-pegRNA-靶标DNA复合物。终止结构以及功能分析揭示，M-MLV RT在预期靶标位点之外延长逆转录，导致由支架驱动的整合，从而在靶标位点产生不需要的编辑。此外，在预起始、起始和延长状态之间的结构比较显示，在逆转录过程中，M-MLV RT始终相对于SpCas9保持一致的位置，而pegRNA合成的DNA杂合双链在SpCas9的表面积累。在对结构的深入理解的基础上，研究团队进一步理性设计了pegRNA变体以及将M-MLV RT融合在SpCas9中的先导编辑器变体。

先导编辑的逐步作用模型

总的来说，这项研究为先导编辑系统的逐步作用机制提供了结构性见解，并为开发多功能的编辑工具箱铺平了道路。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07497-8

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