CRISPR-Cas系统是原核生物（细菌及古菌）中的适应性免疫系统，已被开发作为包括基因治疗在内的各种应用中的基因编辑工具，其中，由向导RNA（gRNA）和单个Cas效应蛋白组成的Cas9和Cas12系统是真核细胞基因组编辑中最常用的。与Cas12蛋白相比，Cas9蛋白结构更复杂，其额外的HNH内切核酸酶结构域使Cas9在基因组工程中更高效和多功能，例如，Cas9切口酶（Cas9 nickase）还被用于构建碱基编辑器和先导编辑器。这些基于Cas9的基因编辑器扩大了基因组工程的范围，并显著拓宽了应用场景。然而，这些编辑器尺寸太大，对高效递送带来挑战，尤其是对于腺相关病毒（AAV）介导的体内基因治疗。 2021年9月，张锋团队在 Science 期刊发表论文，发现了一类广泛的转座子编码的RNA引导核酸酶，并将其命名为OMEGA系统（包括IscB、IsrB、Tnp8），它们同样使用一段RNA（ωRNA）来指导切割DNA双链。其中IscB–ωRNA系统被认为是CRISPR–Cas9系统的祖先，更重要的是，IscB非常小，只有400多个氨基酸，这意味着它们可被开发为新的微型化基因编辑工具，从而更容易被递送到细胞内。之后，张锋、可爱龙等人发表了了一系列论文，解析了IscB-ωRNA的结构，及其切割DNA的机制。然而，IscB在哺乳动物细胞中的活性非常有限，这限制了其应用，当然，这也说明对其进行工程化改造具有很大的潜力。2024年8月2日，华东师范大学李大力团队与邦耀生物团队合作，在 Cell 子刊 Molecular Cell 上发表了题为：Engineering IscB to develop highly efficient miniature editing tools in mammalian cells and embryos 的研究论文。该研究开发了基于IscB的高活性微型基因编辑工具——eIscB-D，在此基础上开发出高活性微型碱基编辑器——eiABE和eiCBE，率先实现了IscB系统在哺乳动物体内的高效基因编辑。在这项最新研究中，研究团队开发了一种进化版IscB——eIscB，通过多轮结构引导的工程化改造，其活性平均增加了7.5倍。通过将序列非特异性DNA结合蛋白结构域HMG-D与eIscB融合，构建的eIscB-D效率进一步提高，在哺乳动物细胞中的编辑效率可高达91.3%。此外，研究团队还设计了工程化ωRNA——eωRNA，长度将至165个核苷酸，相比野生型ωRNA缩短约20%，与原始IscB-ωRNA系统相比，经过工程改造的eIscB-D-eωRNA系统的活性平均增加了20.2 倍。此外，研究团队通过将腺苷脱氨酶TadA-8e或胞嘧啶脱氨酶hAPOBEC3A（hA3A）与进化的IscB切口酶（eIscBH339A）融合，构建了两种具有超高活性的迷你碱基编辑器——eiABE和eiCBE，它们能够在eωRNA引导下有效地诱导A to G 和 C to T的编辑，编辑效率分别可达到73.6%和79.2%。最后，研究团队首次证实了IscB系统在小鼠体内中同样具有高活性，研究团队通过向小鼠胚胎注射mRNA形式的eIscB-D-eωRNA系统，靶向编辑Tyr基因的1号外显子，破坏白化基因的表达，并成功构建了白化病小鼠模型，12只小鼠中，有9只实现了高效基因编辑（平均编辑效率58.8%），其中5只表现出完全白化表型。这表明了该研究开发的微型基因编辑工具可用于生成人类遗传疾病动物模型。总的来说，该研究开发了基于IscB的高活性微型基因编辑工具，不仅可在哺乳动物细胞中实现了高效基因编辑，还首次在小鼠体内实现了高效基因编辑，这为使用单AAV载体递送的碱基编辑器和先导编辑器奠定了基础，具有巨大的应用潜力。据悉，研究团队已成功搭建全新的基因编辑核酸酶筛选平台，正在对新一代基因编辑工具进行持续开发和优化，旨在为创新药物开发提供坚实的技术支持，全力加速推动临床成果转化。华东师范大学博士研究生薛念念、硕士研究生洪迪珊、博士后张丹以及硕士研究生王茜为论文共同第一作者，华东师范大学为第一单位，华东师范大学李大力研究员、朱一凡副研究员、王立人副研究员为论文共同通讯作者。华东师范大学生命科学学院刘明耀教授，宋高洁研究员、关玉婷研究员、新加坡国立大学胡纯一教授等对该研究提供了重要支持。https://www.cell.com/molecular-cell/abstract/S1097-2765(24)00583-5
微信加群 为促进前沿研究的传播和交流，我们组建了多个专业交流群，长按下方二维码，即可添加小编微信进群，由于申请人数较多，添加微信时请备注：学校/专业/姓名，如果是PI/教授，还请注明。