基于质谱的蛋白质组学在加速药物发现中的新角色

蛋白质组学

蛋白质是大多数药物的靶点，目前，通过将新的生化方法与基于质谱的蛋白质组学相结合，能够从全新的维度对疾病表型及其生物活性分子的调节机制进行剖析。最近，德国慕尼黑马克斯普朗克生化研究所（Max Planck Institute of Biochemistry）等研究团队在Nature Reviews Drug Discovery上发表了题为The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery的综述文章。

药物发现主要涉及三个方面：药物、靶点、疾病表型。因此，药物发现工作可以从不同的实验起点着手，例如，从靶点假设开始或由生物活性化合物探究疾病的模型开始（图 1）。

图 1：基于质谱的蛋白质组学在临床前药物发现过程中的应用。蛋白质组学方法用于靶点识别、靶点验证并监测药物的安全性和有效性。

基于靶点的策略可以通过大型文库的高通量筛选（HTS）或基于片段的方法来识别与重组靶蛋白结合的小分子。一旦识别出目标分子，就会在细胞或体内模型系统中针对这些分子的亲和力、物理和化学特性、吸收和分布以及靶点结合、功效和安全性进行优化。

蛋白质在多个层面受到调控，包括表达、转运、亚细胞定位以及与控制蛋白质活性和结构的其他生物分子的非共价或共价相互作用。基于质谱（MS）的蛋白质组学已经达到了可以在几个小时内简化分析几乎完整蛋白质组的水平（图 2）。现代蛋白质组学方法可以检测生物活性分子的作用和反应性，解决蛋白质信号网络中的时空动态难题，并在蛋白质组范围内对翻译后修饰（PTM）进行全面的功能注释。

图 2：主要的蛋白质鉴定和定量策略

靶点识别

基于 MS 的蛋白质组学有助于直接分析小分子与蛋白质组的相互作用。

基于探针的靶向反卷积。使用标记的生物活性小分子和基于 MS 的定量蛋白质组学的亲和富集相结合，为全面分析细胞蛋白质组内的药物相互作用提供了一种敏感而特异的工具。这种技术通常被称为以化合物为中心的化学蛋白质组学 (CCCP)（图 3b）。

为了使 CCCP 能够识别功效靶点，需要相关化合物的构效关系 (SAR) 的详细信息，以保留用于蛋白质靶点亲和捕获并随后通过 MS识别类似物的生物活性。小分子探针和靶蛋白之间的相互作用可以通过光反应性基团（如二氮丙啶和芳族叠氮化物）的光亲和标记 (PAL) 转化为共价键（图 3b，原位 CCCP），而且这些共价键能够探测活细胞中参与的靶点。然而，由于蛋白质与引入化合物中的修饰物（如反应基团等）和实验工作流程中的其他底物表面等的非特异性结合，识别功效靶点并非易事。如果可行，使用源自所研究化合物的活性和非活性类似物的探针进行比较实验分析，可以在差异纯化的基础上有效地筛选候选靶蛋白。

图 3：通过分析蛋白质亲和力、活性、稳定性和折叠研究药物作用的蛋白质组学策略

无需化学探针的靶点解卷积。最近，出现了几种无需探针即可检测小分子蛋白质结合的蛋白质组学方法。它们利用配体诱导的对靶蛋白生物物理特性的影响，在变性剂存在的情况下，测量热稳定性、蛋白水解抗性或氨基酸侧链表面显示的变化。这些方法与定量 MS 的结合实现了蛋白质组范围内的测定。例如，热蛋白质组分析 (TPP) 也称为细胞热位移分析 (CETSA) - MS 可以通过分析药物诱导的蛋白质组中蛋白质热稳定性变化来破译药物的 MoA（图 3d）。基于裂解物和基于细胞的实验比较可以检测和区分由于蛋白质与化合物的直接相互作用引起的热稳定性变化以及由于下游效应引起的变化，例如蛋白质与不同生物分子类别或 PTM 的相互作用。

基于探针的化学蛋白质组学可以实现低丰度靶点或靶点类别的特异性富集，然而，由于结合位点的化学性质以及为实现亲和富集而引入的化学修饰和空间变化，探针在检测细胞蛋白质组时也引入了固有的偏见。因此，对于CCCP方法通常需要多个化学探针来全面表征细胞内和细胞外靶点。相反，基于生物物理或生物化学原理的直接靶点分析，可以在广泛的亲和力范围内检测小分子-靶点相互作用，不需要耗时的探针设计，并且由于蛋白质组覆盖范围的敏感性和深度增加以及周转速度加快，正逐渐变得更具吸引力。

识别 MoA 的间接策略

作为直接检测药物靶点参与度的替代方法，潜在靶点或靶点通路可以从药物治疗中观察的表型和分子指纹间接推断出来。基于 MS 的蛋白质组学结合细胞生物学和生化方法的多方面最新发展，也使得检测蛋白质的多种功能特性成为可能（图 4）。

蛋白质丰度。每种蛋白质的丰度取决于其基因转录、RNA 剪接和翻译。尽管转录水平通常被用作蛋白质丰度的代表，但对 mRNA 与蛋白质水平的系统评估表明它们之间只有部分和条件依赖的相关性，因此蛋白质组水平的量化更为明确。

全局蛋白质组分析检测反应了药物治疗的蛋白质丰度（图 4a）。蛋白质组随时间的变化可以反映想要化合物效应，但也可以反映副作用或恢复可能导致耐药性的体内平衡的补偿机制。

蛋白质定位。为了绘制跨多个亚细胞区室的空间蛋白质动力学图谱，分离细胞器的蛋白质组学分析和基于邻近连接的蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络同样成为强大的工具。这些“蛋白质相关性分析”方法的现代形式通过它们在组分中的定量分布将蛋白质分配到亚细胞区，克服了难以实现的纯化细胞器的要求。

蛋白质相互作用。阐明PPI的经典方法是通过免疫沉淀或亲和纯化单个内源性或表位标记的蛋白质来捕获直接和间接的蛋白质相互作用物（图4d）。不管药物是否存在，都可以对蛋白质复合物的组成进行分析，这使得检测化合物敏感的 PPI 以及探索化合物调节靶点活性的机制得以实现。

特异性与非特异性 PPI 的区别对于解释相互作用蛋白质组学实验至关重要。为此目的的分析策略包括用一种以上的针对靶点的抗体进行富集，同种型匹配的阴性对照，以及共同富集的污染物的实验和计算机描述。定制的交联和生化策略可以解析弱结合剂与直接和间接结合剂以及蛋白质相互作用的3D结构信息。

蛋白质翻译后修饰。用于全面检测稳定的 PTM 修饰肽的蛋白质组学方法已经确立，可用于监测药物诱导的信号变化（图 4c）。

全面磷酸化蛋白质组学常用于检测 RTKs 和下游的信号通路激活或抑制，因此，它可以通过识别活化或药物抑制激酶的底物来补充化学蛋白质组学方法。磷酸化蛋白质组学还通过“偏向激动”阐明了 GPCR 信号的配体选择性调节，并成功地将药物作用归因于血管紧张素 II 和 β-肾上腺素能受体下游所需通路激活的功能。

靶点的发现和验证

在药物发现过程的早期，对潜在药物靶点进行深入的分子和功能分析，有助于验证药物靶点的真实性。目前，基于 MS 的工作流程（图 2）提高了蛋白质组学的灵敏度，可以分析微量样品。为了解决由组织异质性引起的分析挑战，激光捕获显微切割有助于分析不同的细胞类型或状态，例如基质与肿瘤，并且可以直接分析大队列 FFPE 组织样本。

药物安全性和有效性

最近的一项分析报告表明，60%失败的化合物是由于临床前毒性而被终止，其中 40% 是由于 I 期和 II 期临床试验中的安全考虑。药物多向药理学不一定是负面的，因为作用于多个靶点的药物可能更有效，并能发现脱靶作用，这可能代表药物再利用的机会。

二级药理学筛选可以识别与所研究候选药物分子的 MoA 相关的关键蛋白质，包括理想和不理想的药物反应。然而，工业试验分析组主要涵盖构成药物发现中既定靶点类别的少数蛋白质家族，以及在药物不良反应中具有已知作用的蛋白质。基于蛋白质组学的技术消除了对特定分析组的需求，因此能够对整个蛋白质组的化合物脱靶进行更全面和更少偏见的评估（图 1）。

脱靶评估。蛋白质组学能确定一些令人意外的不良事件的药物作用机制。如在一项开创性的研究中，CCCP方法发现，沙利度胺最初是用于预防怀孕期间的恶心，但它通过与cereblon结合而产生致畸作用。

药物和药物代谢物的加合物。当药物或药物代谢物形成损害基本蛋白质功能或引发免疫反应的共价蛋白质加合物时，就会产生毒性。

在早期阶段推动创新

靶向共价抑制剂。蛋白质组学可以帮助利用可逆配体设计靶向共价抑制剂，研究共价配体亲和性，如布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）的共价抑制剂以及其他临床I期和II期试验中的三种候选药物，它们针对癌蛋白KRAS的G12C突变体中的半胱氨酸，是几十年来一直被认为不可成药靶的。在这些实验中，相应的肽片段谱提供了主要蛋白质靶点的共价修饰氨基酸残基的直接证据（图4e）。

通过基于片段的配体发现拓展化学基因组学空间。使用亲电小分子的化学蛋白质组学可分析鉴定数百种蛋白质的配体，包括已确定的药物靶点，以及尚未被药物靶向的蛋白质等。将手性整合到完全功能化的片段文库中，也可以识别细胞中大量的立体选择性蛋白质-片段相互作用。基于片段的蛋白质组学分析显然有望扩大化学蛋白质组学空间，并使生物活性小分子及其分子靶点的协同发现成为可能。

靶向降解剂。小分子降解剂的开发，包括分子胶和异双功能降解剂，为以前被认为无法成药的蛋白质的药理学干预提供了一种新模式，令人期待。

PROTAC 由两个连接的配体组成，一个与感兴趣的靶点结合，另一个招募 E3 泛素连接酶，触发泛素化和随后的蛋白酶体降解靶点蛋白。在两项突破性研究中，表达蛋白质组学揭示了转录共激活因子（包括 BRD4）的选择性蛋白质降解，以响应与邻苯二甲酰亚胺融合 BET 溴结构域的竞争性拮抗剂的治疗。此外，相互作用蛋白质组学揭示了由 PROTAC 诱导的选择性三聚体复合物形成，PROTAC靶向作用于受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 2 (RIPK2) ，介导 RIPK2 募集到 von Hippel-Lindau (VHL)-CRL 复合物并最终导致激酶的泛素化和降解。

图 4：通过分析蛋白质丰度、定位、相互作用和修饰来研究药物作用机制和疾病生物学的蛋白质组学策略。

展望

本文总结了蛋白质组学分析领域所取得的许多进步和成功应用，尽管与 RNA 测序方法等其他组学技术相比，蛋白质组学技术仍然缺乏敏感性，覆盖范围仍然不足，但我们相信，蛋白质组学的相关流程目前在逐渐成熟，定能在之后为疾病和药物作用的机制提供更多直接相关的研究。

DOI: https://doi.org/10.1038/s41573-022-00409-3

本文译自Nature Reviews Drug Discovery。

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