科研 | Redox Biol：单克隆丙种球蛋白病发展为Waldenstrom巨球蛋白血症与脂质代谢的改变有关

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编译：微科盟阿温，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

调节免疫球蛋白M类（IgM-MGUS）的意义未明的单克隆丙种球蛋白病发展为Waldenstrom巨球蛋白血症（WM）的分子事件大多是未知的。我们对患者血清样本进行比较蛋白质组学和代谢组学分析，以确定对IgM-MGUS向WM进展至关重要的差异表达分子。我们的数据表明，脂代谢改变是MGUS、WM和匹配正常对照组之间的一个区别因素。与MGUS相比，WM血清中许多脂肪酸水平显著下调，包括多不饱和脂肪酸和二羧酸。这些减少与WM和MGUS患者样本中15-LOX和PPAR蛋白表达减少以及5-LOX和GPX4表达增加有关。此外，WM血清样品显示，与MGUS相比，脂质过氧化增加。IL-6或TNFα是MGUS和WM差异表达蛋白的上游调节因子，可增加WM细胞系的脂质吸收和脂质过氧化。敲低15-LOX表达可提高WM细胞存活率，这种效应伴随着5-LOX和GPX4表达的增加。总之，我们的数据显示WM患者血清中脂肪酸和脂质代谢物水平降低与脂质过氧化增加有关，15-LOX的下调增加了WM细胞的存活率。这些数据对于确定疾病进展的生物标志物和设计有针对性的治疗干预具有重要意义。

论文ID

原名：Progression from Monoclonal gammopathy of undetermined significance of the immunoglobulin M class(IgM-MGUS) to Waldenstrom Macroglobulinemia is associated with an alteration in lipid metabolism译名：从免疫球蛋白M类（IgM-MGUS）的单克隆丙种球蛋白病发展为Waldenstrom巨球蛋白血症与脂质代谢的改变有关
期刊：Redox Biology
IF：9.986发表时间：2021.03通讯作者：Stephen M. Ansell & Shahrzad Jalali
通讯作者单位：美国梅奥医院

实验设计

1. 采用定量无标记蛋白质组分析LPL细胞渗入BM以及这些细胞的增殖和IgM分泌与一系列可能改变蛋白质表达和代谢物水平的分子事件，然后进行PCA和IPA分析；

2. 进行全面的代谢组学分析，并比较MGUS和WM血清样品的脂质谱；

3. IHC染色比较MGUS与WM样品中15-LOX的表达；

4. RNA-seq分析MGUS和WM之间蛋白质表达差异的原因；

5. 用IL-6或TNFα处理WM细胞系，并在48小时后用荧光标记的BODIPY脂质探针测量脂质吸收。

实验结果

1. 正常、IgM-MGUS和WM患者血清样本的蛋白质组特征
LPL细胞渗入BM以及这些细胞的增殖和IgM分泌与一系列可能改变蛋白质表达和代谢物水平的分子事件有关。为了探讨这种变化在WM疾病进展中的意义，首先我们采用了定量无标记蛋白质组学分析，并比较了三组正常（n=22）、MGUS（n=25）和WM（n=41）血清样本的蛋白质组谱，LC-MS/MS分析鉴定出三组共有958个蛋白质。此外，在WM和MGUS（n=56）、正常和WM（n=49）或正常和MGUS（n=17）之间也有一些共同的蛋白质。与预期的一样，也有一些蛋白是正常（n=34），MGUS（n=17）和WM（n=20）所特有的。我们利用每个样本的总蛋白质丰度数据进行主成分分析（PCA），结果显示正常样本聚在一起，而MGU和WM聚在一起，但与正常样本不同（图1B）。同样地，使用层次聚类和热图分析，我们发现MGUS和WM之间的相似度高于正常人和MGUS或WM之间的相似度（图1C），这意味着MGUS和WM是相关的疾病实体。通过统计分析，我们确定了在WM组与MGU组（n=144向上；n=78向下）、WM组与正常组（n=139向上；n=89向下）以及MGU组与正常组（n=144向上；n=141向下）的差异表达蛋白（图1D和2A，B，C）。蛋白登录号和丰度比概述如下。补充表1：我们生成了正常、MGU和WM样本中独特蛋白质的热图（图2D）。部分蛋白仅见于WM，包括胰岛素生长因子结合蛋白-1（IGFBP1）、转铁蛋白受体（TFRC）和半乳糖皮质激素2（HMCN2）。同样，少数蛋白只在正常对照组中发现，而在MGUS和WM中没有发现，包括组蛋白乙酰转移酶B型催化亚基（HAT1）、DNA解旋酶（MCM2）、细胞分裂周期蛋白42（CDC42）、线粒体热休克蛋白（HSPE1）。有趣的是，我们在正常或WM样本中均发现了属于MGUS的蛋白质（图2D），这支持了MGUS患者的蛋白质组学特征与正常对照组和WM患者相同的观点，因此代表了一个中间阶段。为了探索受差异表达蛋白影响的改变的通路，我们接下来进行了巧妙的通路分析（IPA）。通过对WM和MGUS样本的比较，我们发现肝X受体-视黄酸X受体（LXR-RXR）信号激活是最具差异的激活途径，Z评分=2.236，log p值=3.582（图2E）。这一预测基于上游分子的表达增加，包括载脂蛋白L1（APOL1），其在WM中的表达比MGU高100倍，并有望增加LXR-RXR激活的配体。LXRs属于核受体，包括RXRs在内的其他核受体超家族异二聚，从而调节脂质、胆固醇和脂肪酸代谢。因此，LXR/RXR激活的改变可能表明，与MGUS患者相比，WM患者的脂质代谢稳态受到干扰。IPA分析还根据MGU和WM之间蛋白质表达谱的改变预测了TNFα和IL-6作为WM上游调节因子的激活（补充表1）。有趣的是，我们的数据显示，磷脂酶A2，IIA组（PLA2G2A），在WM组明显高于MGUS血清（>2倍）。PLA2G2As水解细胞膜中甘油磷脂中的sn-2酯键，并产生脂肪酸和溶血磷脂，这些脂肪酸和溶血磷脂可作为第二信使发挥作用，或进一步代谢为参与炎症和增殖等细胞过程的介质。先前的研究表明PLA2G2A的表达是由TNFα诱导的，这表明肿瘤微环境中改变的细胞因子有助于WM的脂质代谢。 图1 正常（NM）、MGUS和WM血清样品的无标记定量蛋白质组分析。从25 NM、25 MGUS和41 WM样本中采集血清样本，然后进行LC-MS/MS分析。A）维恩图显示了不同样本组之间共同存在的独特蛋白质的总数。B）从NM、MGU和WM样本收集的总蛋白质丰度数据的PCA分析。数据表明所有NM样品（橙色）的蛋白质丰度紧密聚集，而MGUS（蓝色）和WM（绿色）样品显示出变异性，但与NM样品不同。C）NM、MGUS和WM样本中所有组蛋白丰度的层次聚类和热图分析。D）火山图显示了1156个定量蛋白质峰面积的折叠变化与q值。红圈和绿圈分别代表显著的（q<0.05）上调和下调蛋白。灰圈（q = 0.05）无统计学意义。
 图2 蛋白质显著增加或减少的比较分析。A）条形图表示组间显著改变的蛋白质的数量。B&C）维恩图显示组间上调或下调蛋白的关系。D）热图显示NM、MGUS和WM血清样本中鉴定出的独特蛋白质。每个蛋白质的肽谱匹配数（PSMs）用于生成热图(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)。E）条形图表示WM中显著高于MGU的蛋白质的IPA途径分析。条形图颜色表示z分数（红色：z分数=2；白色：z分数=0，灰色：无活性）。
 2. 代谢组学分析比较MGUS和WM血清样本的脂质谱
细胞代谢的改变与特定代谢物的积累或消耗有关，这些代谢物可以作为疾病进展的生物标志物。基于LXR-RXR和PLA2G2A信号可能改变MGUS向WM进展过程中的脂质代谢，我们进行了全面的代谢组学分析，并比较了MGUS和WM血清样品的脂质谱。我们的数据显示225种脂质代谢物中有67种在MGUS和WM之间存在差异（图3A）。MGUS样本具有高水平的炎症和脂肪酸产物，包括类固醇、环氧化酶（COX）、单不饱和脂肪酸（MUFA）、多不饱和脂肪酸（PUFA）、短链脂肪酸、二羧酸、前列腺素和丝裂原，支持MGUS的炎症状态（图3B）（补充表2）。MGU和WM之间最有力的区分是MGU中短链二羧酸的丰度（图3D）。这些是脂肪酸氧化产物和线粒体的碳燃料，它们也能影响B细胞的活化。两组之间的其他鉴别因子是维生素D2、维生素原D3（7-脱氢胆固醇）、24-脱氢胆固醇，这些因子在WM患者中降低（图3C）。虽然大多数脂质代谢物在WM中表达下调，但与MGU相比，特定代谢物，包括花生四烯乙醇胺（AEA）、花生四烯酸衍生物酸、雄酮和19-羟基雄烯二酮在WM中高表达（图3E）。为了确定下调的脂肪酸水平是否可以作为治疗反应的生物标志物，我们比较了不同治疗反应的WM患者的血脂水平。有趣的是，对治疗有部分或完全反应的患者，其脂肪酸水平明显高于未治疗或难治患者。相反，在反应或缓解组中，前列腺素B2和三月桂酸甘油酯（C12:0）的水平下降（图3F）。 图3 代谢组学分析比较MGUS和WM血清样本的脂质谱。A）比较MGUS和WM血清样品脂质代谢物的火山图。Y轴：p值（截止值为0.05），X轴：倍数变化。B）条形图显示各组代谢产物的数量在MGUS和WM之间有显著变化。C、D&E）点图比较MGU和WM样品之间的代谢物。显著性差异描述为**p<0.01和***p<0.001，脱氢胆固醇（DHC）。F&G）线形图比较WM患者之间的脂质代谢物和脂肪酸。
 3. 5-脂氧合酶和15-脂氧合酶在MGUS和WM中的差异表达
脂氧合酶（LOX），包括5-LOX和15-LOX，氧化花生四烯酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸，并产生二十烷酸，这些烷酸进一步代谢为白三烯或氧化亚油酸产物，介导炎症反应。MGU和WM之间脂肪酸水平的改变，包括WM中亚油酸水平的降低和花生四烯酸代谢物水平的升高（图3E），以及血清磷脂酶A2（一种从膜磷脂中释放花生四烯酸的催化酶）蛋白质丰度的增加（补充表1，WM与MGUS中的上调蛋白），暗示我们检测MGUS和WM BM组织切片中5-和15-LOX的表达（每个WM或MGUS患者n=5）。IHC染色显示，与WM样品相比，MGUS中15-LOX的表达增加，5-LOX的表达减少（图4和5A）。RNA-seq数据也显示WM B细胞中15-LOX的显著减少（图4B）。由于在蛋白质组学分析中发现IL-6和TNFα被激活，并且可能是MGUS和WM之间蛋白质表达差异的原因，我们用IL-6或TNFα处理WM细胞系并检测5-LOX和15-LOX的表达。用IL-6或TNFα处理细胞可降低两种WM细胞系中的15-LOX RNA表达（图4C），表明这些细胞因子的升高是在疾病从MGU进展到WM期间降低15-LOX表达的关键因素。与15-LOX相反，IL-6或TNFα处理增加了两种WM细胞系中5-LOX的表达（图4D），表明5-LOX和15-LOX可能在MGU和WM的生物学中起相反的作用。与MGUS样品相比，WM中过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）家族的蛋白减少。PPAR是由脂肪酸激活的转录因子的核受体家族，调节脂质稳态。PPAR有三种亚型，即PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，它们参与脂肪酸代谢、脂质生物合成和脂肪酸氧化。几种天然亲脂性酸，包括通过LOX代谢的亚油酸和花生四烯酸的酶衍生物，如花生四烯酸，可以作为配体与PPARγ结合，并阻止炎症信号。为了研究WM中脂肪酸水平的降低、脂质分布的改变和炎症反应的增加（图3）是否也与PPARs蛋白表达的改变有关，我们比较了MGUS和WM之间PPARs的表达。我们发现WM患者的BM组织中PPARγ、PPARβ/δ和PPARα的表达低于MGUS BM样本（图4E）。对来自WM和MGUS患者样本的分选B细胞的RNA序列数据分析也显示，与MGUS B细胞相比，WM中的PPARγ表达显著降低（图4F），证实了从IHC分析获得的数据。 图4 脂肪氧化酶和PPAR家族蛋白在WM和MGUS中的表达。A）典型的IHC染色显示MGUS和WM-BM切片中有15-LOX和5-LOX的表达（棕色，放大40倍）。B）RNA-seq数据比较了MGUS和WM-BM细胞的B细胞中15-LOX的表达。C）RT-PCR分析比较IL-6和TNFα对15-LOX表达的影响。有效值表示为**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。D）流式细胞术分析显示IL-6或TNFα治疗后5-LOX表达。E）代表性IHC染色比较MGUS和WM切片中PPARγ、PPARα和PPARβ/δ（棕色，放大40倍）的表达。F）RNA-seq数据显示MGUS和wmb细胞之间PPARϒ表达存在显著差异（***p<0.001）。
 4. IL-6和TNFα诱导的脂肪酸吸收和脂质过氧化增加
WM患者血清中脂肪酸水平的降低可能是由于特定酶水平的降低，这些生物分子被恶性细胞吸收的增加，以及随后对特定代谢途径的利用。为了证明肿瘤微环境中的细胞因子是否能诱导脂肪酸吸收增加，我们用IL-6或TNFα处理WM细胞系，并在48小时后用荧光标记的BODIPY脂质探针测量脂质吸收。如图5A所示，IL-6和TNFα均增加了两种WM细胞系中的脂质吸收，表明肿瘤微环境中的细胞因子可诱导脂肪酸吸收。我们最近报道WM肿瘤微环境处于氧化应激升高的状态。这种痛苦，加上谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）活性的增加，表明脂质可能正在经历脂质过氧化。因此，我们检测了对IL-6或TNFα的脂质过氧化反应，发现这些细胞因子可以增加两种WM细胞系的脂质过氧化（图5B）。与此数据一致，我们还发现WM血清样品的脂质过氧化水平显著高于MGUS（图5C），表明WM样品比MGUS处于更高的氧化应激下，这导致脂质过氧化水平升高。 图5 IL-6或TNFα治疗对脂质吸收和脂质过氧化的影响。A）流式细胞术分析显示使用脂质探针（BODIPY 493/503）增加脂质吸收。重叠直方图显示荧光强度的变化（绿色：未染色；红色：未处理；蓝色：IL-6；橙色：TNFα）。B）流式细胞术分析显示IL-6或TNFα治疗后FITC阳性细胞（过氧化）的百分比。C）比较MGUS和WM血清样品中脂质过氧化的丙二醛（MDA）测定（**p<0.001）。
 5. 抑制15-LOX表达可促进WM细胞存活，并与5-LOX和GPX4表达增加有关
研究表明，LOXs氧化多不饱和脂肪酸（PUFA）会增加脂质氢过氧化物（LOOH）。LOOH的生成主要通过铁介导的自由基自氧化和LOX催化的多不饱和脂肪酸氧化来实现。因此，我们通过抑制15-LOX的表达来检测15-LOX在WM细胞活力中的作用。我们的数据显示，15-LOX siRNA转染后，BCWM.1和MWCL-1细胞系的细胞存活率均增加（图6A），表明15-LOX水平降低与WM中肿瘤细胞存活率增加有关。我们的数据还显示在WM患者BM切片中GPX4的表达增加（图6B）。众所周知，GPX4在铁下垂和脂质过氧化过程中起着关键作用，GPX4的激活可克服铁和脂质过氧化诱导的细胞死亡。值得注意的是，我们发现在BM细胞中GPX4的表达更高，BM参与的比例更高（补充图1）。有趣的是，15-LOX基因敲除上调GPX4和5-LOX的表达（图6C），这两种基因都参与促进细胞存活和抑制细胞凋亡。此外，我们证明使用5-LOX药理抑制剂CJ-13、610抑制5-LOX可增加用IL-6或IL-21处理的细胞的凋亡（图6D），这提供了额外的证据，证明激活5-LOX（相对于15-LOX）可促进WM细胞的存活。 图6 5-LOX和15-LOX抑制对WM细胞基因表达和细胞存活的影响。A）具有代表性的Annexin/PI染色显示转染15-LOX siRNA后WM细胞活力增强。B）IHC染色比较MGUS和WM患者BM切片（棕色，放大40倍）中GPX4的表达。C）条形图显示15-LOX基因敲除对5-LOX和GPX4基因表达的影响。显著值表示为*p<0.05，**p<0.01。D）Annexin/PI染色显示IL-6或IL-21处理后凋亡细胞的百分比，无论是否使用10 μM CJ-13610。E）示意图显示了描述脂肪酸代谢变化如何促进WM肿瘤细胞存活的数据。

讨论

WM的发病机制主要归因于主要在MyD88和CXCR4基因中发现的体细胞突变。然而，在IgM-MGUS的癌前状态中也发现了这些基因的突变，而这些突变是否参与了MGUS向WM的转化仍然未知。因此，有必要确定从MGUS向症状性疾病过渡的其他机制。鉴于代谢在调节肿瘤发生中的关键作用，我们利用综合蛋白质组学和代谢组学分析来探讨MGU和WM之间的区别代谢特征。血清蛋白质组学分析显示正常、MGUS和WM患者样本具有明显的聚集性。然而，MGUS和WM样本比正常样本聚类更近，表明它们是相关疾病。这与先前的报道一致，即MGUS和WM克隆B细胞之间的表型和遗传相似程度更高。我们在WM中发现了一些独特的蛋白质，但在MGUS样本中没有发现，包括IGFBP1、TFRC和半胱胺酸2（HMCN2）。先前的数据已经报道了IGFBP1的表达增加及其与前列腺癌或胰腺癌风险升高或乳腺癌治疗抵抗的关系。虽然TFRC与铁代谢和贫血有关，但霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤患者血清中TFRC的存在与疾病严重程度相关，而不是与缺铁性贫血相关。我们的数据显示，在WM，而不是MGUS血清中存在IGFBP1和TFRC，可以作为疾病转化的预后和诊断指标。在这里，与MGUS相比，WM上调蛋白的通路分析显示，WM上调蛋白的核受体激活LXR/RXR。LXR/RXR属于配体激活转录因子的核受体家族，参与脂质稳态和脂肪酸代谢。先前的报告表明，多不饱和脂肪酸抑制LXR与LXR反应元件的结合，并抑制参与脂肪酸代谢的甾醇调节元件结合蛋白1c的表达（SREBP-1）。通过对脂质的代谢组学分析，我们发现脂肪酸、类固醇、前列腺素和二羧酸水平发生了显著改变，与MGUS样本相比，WM中的大多数水平下调。血清脂肪酸水平紊乱，如多不饱和脂肪酸水平降低，以前在侵袭性非霍奇金淋巴瘤中已有报道。维生素D2和维生素原D3（7-脱氢胆固醇）在WM中显著减少。大多数弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和多发性骨髓瘤（MM）患者的血清维生素D水平也较低。维生素D对正常和恶性淋巴B细胞祖细胞克隆形成生长的抑制作用也有报道。此外，维生素D已被证明能下调MyD88突变DLBCL的生长和存活相关基因。我们的数据显示维生素D水平降低与WM中恶性B细胞增殖增加是一致的。我们发现WM血清SCFA和二羧酸显著降低。SCFAs可以抑制组蛋白去乙酰化酶（HDACs）并在结肠癌中发挥抗增殖作用。血清SCFA水平的降低可能是肿瘤细胞存活率增加的一个指标。在前列腺癌和卵巢癌细胞中，二羧酸向肿瘤细胞的转运为线粒体提供了能量来源，因此这些代谢物水平的降低可能表明它们在WM细胞中的活跃转运和随后的利用为线粒体提供能量。我们还发现WM患者治疗后的脂质或脂肪酸水平发生了变化，支持了先前的报告，即血浆脂肪酸水平异常可能影响非霍奇金淋巴瘤的治疗反应。我们发现，花生四烯酸代谢（AEA）产生的代谢物在WM高于MGUS血清。花生四烯酸是一种ω-6多不饱和脂肪酸，通过PLA2催化从细胞磷脂中释放，并被LOX氧化生成二十碳四烯酸，二十碳四烯酸是炎症反应的关键代谢物。我们发现WM和MGUS样本中5-LOX表达增加，但15-LOX表达减少，这表明这些酶在WM和MGUS中的作用不同。我们还观察到两种WM细胞系中5-LOX的表达在IL-6和TNFα处理下增加，IL-6和TNFα是WM和MGUS之间几种改变蛋白的两种上游调节因子。此外，抑制5-LOX可增加IL-6或IL-21诱导的细胞凋亡，表明增加5-LOX可促进WM细胞存活。5-LOX表达增加与肿瘤发生之间的联系已经在前面描述过。与5-LOX相反，抑制15-LOX可提高WM细胞活力。这些数据与显示15-LOX在前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中具有抑癌作用的研究一致。先前的报道表明，15-氧合酶的抗肿瘤作用是通过PPARγ介导的对NFκB的抑制而发挥的，NFκB是一种在WM发病机制中具有确定作用的转录因子。我们的数据显示WM BM切片的PPAR家族蛋白表达低于MGUS。PPAR是众所周知的脂质代谢和炎症调节因子，多不饱和脂肪酸和二十碳五烯酸是它们的配体。在多发性骨髓瘤中，PPARγ通过抑制BM基质细胞分泌IL-6来降低细胞生长和存活率。低水平的多不饱和脂肪酸（PUFA）和PPARs的表达降低可改变WM的脂质代谢，促进WM肿瘤细胞的生长。我们还发现，对于细胞因子IL-6和TNFα，WM细胞的脂质吸收增加，伴随着脂质过氧化的升高。有趣的是，WM中的脂质过氧化也高于MGUS样品。脂质过氧化增加是一个与铁依赖性、非凋亡细胞死亡相关的过程，称为铁下垂，发生在活性氧水平增加和GPX4活性不足。我们的数据显示WM中GPX4的高表达表明，GPX4活性抵消了脂质过氧化的升高。此外，我们的数据显示GPX4在15-LOX基因敲除后的上调进一步加强了GPX4在WM中驱动肿瘤细胞存活的事实。总之，我们的结果表明，许多脂质和脂肪酸代谢物在WM与MGUS样品下调。这些减少与核受体的15-LOX和PPAR家族的表达减少，以及5-LOX和GPX4表达的相互增加有关。细胞因子、IL-6和TNFα可增加WM细胞的脂质吸收和脂质过氧化。我们发现15-LOX的敲除增加了WM细胞的活力，这种效应伴随着5-LOX和GPX4的表达增加，表明抑制15-LOX的表达促进了WM细胞的存活和增殖（图6E）。这些数据强调了脂质在促进IgM-MGUS向WM进展中所起的新的代谢作用。因此，进一步了解有利于肿瘤细胞存活的代谢途径对于开发未来的WM治疗干预措施至关重要。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33690107/

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