科研 | Nat. Commun.：不同半胱氨酸氧化还原形式的全球图谱显示秀丽隐杆线虫中广泛的氧化还原调节

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编译：微科盟李可爱，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

翻译后半胱氨酸残基氧化还原状态的改变可以迅速和可逆地改变蛋白质的功能，从而调节生物过程。秀丽隐杆线虫是是研究半胱氨酸介导的氧化还原信号的理想生物研究模型，本文对野生型秀丽隐杆线虫有关半胱氨酸的体内反应进行了全面的、定量的和位点特异性的研究。我们还描述了秀丽隐杆线虫氧化还原体的整体特征，我们测量了H₂O₂处理后的三种主要半胱氨酸氧化还原形式的变化。我们的数据揭示了翻译、生长和应激反应信号通路中的氧化还原事件，并确定了氧化还原调节的半胱氨酸在p38 MAPK通路的信号传递中的重要性。我们深入研究蛋白质组数据为理解体内氧化还原信号提供了分子层面的基础，并将为氧化还原生物学领域提供了有价值的和丰富的资源。

论文ID

原名：Global profiling of distinct cysteine redox forms reveals wide-ranging redox regulation in C. elegans译名：不同半胱氨酸氧化还原形式的全球图谱显示秀丽隐杆线虫中广泛的氧化还原调节
期刊：Nature CommunicationsIF：12.121发表时间：2021.03通讯作者：Keith Blackwell；杨靖
通讯作者单位：哈佛医学院；青岛大学

实验设计

实验结果

1.  映射秀丽隐杆线虫中的高反应性半胱氨酸
尽管半胱氨酸在蛋白质中的丰度相对较低，但半胱氨酸残基经常存在于功能位点，并可能参与催化、配体结合和蛋白质-蛋白质相互作用等过程，这些功能性半胱氨酸通常表现出很高的固有反应性，因此有人认为半胱氨酸的反应性可以预测功能性。为了在蛋白质组范围内量化半胱氨酸的反应性，在一项开创性的工作中，Cravatt和他的同事使用了一种“可点击的”硫醇反应探针对天然蛋白质组进行剂量依赖的标记。原则上，在低探针浓度下，高活性半胱氨酸会使标记饱和，而不稳定的半胱氨酸则会表现出浓度依赖性的标记增加，这一策略在哺乳动物细胞中的应用表明，高反应性确实是半胱氨酸功能的一个很好的预测指标，尽管一些固有的反应性和功能性半胱氨酸可能由于化学或立体原因而无法被探针获得。基于同样的原理，我们最近发展了一种名为定量硫醇反应性图谱(QTRP)的化学蛋白质组学方法，并系统地研究了果蝇和哺乳动物细胞中半胱氨酸的反应性。在这项研究中，我们首先通过将QTRP应用于野生型L4期动物，对秀丽隐杆线虫的半胱氨酸反应性进行了全局分析。在非变性条件下裂解秀丽隐杆线虫，然后用100µM或10µM的IPM探针处理(图2A)，共测定了5258个半胱氨酸的高剂量和低剂量IPM(R100：10)的标记比例，其中52.0%(2735)在至少两个生物重复中定量。值得注意的是，大于90%的可重复量化位点的变异系数(CV)值低于40%，中位值为13.4%，表明了我们数据的重复性。通过绘制大约4400个额外的半胱氨酸位点，我们的结果大大扩大了秀丽隐杆线虫半胱氨酸体的覆盖范围，这些半胱氨酸体是在之前的胰岛素样信号通路突变体21的研究中获得的(图2B)。在这两项研究中检测到的所有半胱氨酸位点中，24.1%(107个)显示出相似的R100：10值，无论遗传背景的差异(野生型或daf-16、daf-2双突变体)(图2C)。我们将R100：10值低于或等于3.0的半胱氨酸定义为高度反应性，将R100：10值高于3.0但不高于6.0的半胱氨酸定义为中度反应性。为简单和一致起见，截断比数值是根据以前发表的报告进行经验定义的。总体而言，高活性半胱氨酸占所有量化位点的24.6%(5258个位点中有1292个)，而中度半胱氨酸占43.1%(5258个位点中有2266个)。由于UniProt知识库中的功能注释信息不完整，要在特定的蛋白质结构域中定位所有反应性半胱氨酸，从而评估它们预测的功能重要性是具有挑战性的(图2D)。尽管如此，许多已知的催化和/或氧化还原敏感型半胱氨酸仍具有很高的活性。例如，谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX-2)中进化保守的活性位点C3625的R100：10值为2.68(补充数据1)。我们注意到，一些非催化半胱氨酸比蛋白质中已知的活性或氧化还原敏感位点更具活性。例如，泛素激活酶UBA-1中的活性半胱氨酸C68126的R100：10=5.49，而非催化残基C543的活性更强，R100：10为2.32(图2e)。一种可能性是，反应性半胱氨酸可能以非催化方式发挥作用，或者可能通过氧化以外的其他途径进行修饰(例如，S-棕榈酰化、基于脂质的亲电S-加成反应)。我们的半胱氨酸反应性数据集包括许多保守的半胱氨酸，这些半胱氨酸的反应性先前在培养的人类细胞中进行了评估。有趣的是，54%的半胱氨酸在两个物种中被检测到具有相似的内在反应性。例如，谷胱甘肽S-转移酶GSTO-1中的活性半胱氨酸C33在秀丽隐杆线虫(R100：10=1.1)(图2F)和智人(R100：10=0.9)中表现出几乎相同的反应活性。值得注意的是，在对虾中保守的半胱氨酸经常(但不总是)显示相似的R100：10值。例如，C158是人甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的所有四个同源物(GPD-1到GPD-4)中的活性位点，GPD-1和GPD-2/3中的C158显示非常相似的R100：10值分别为5.89和5.27，尽管GPD-4中的C158显示出更高的R100：10(图2G)。这些结果表明，氨基酸序列水平的保守性可能与半胱氨酸的内在反应性有关，尽管侧翼序列的细微变化可能会影响半胱氨酸的反应性。图1 化学选择性探针标记半胱氨酸氧化还原形式IPM是基于碘乙酰胺的半胱氨酸硫醇（–SH）炔烃探针；BTD是基于苯并噻嗪的炔烃探针，用于半胱氨酸亚磺酸（–SOH）29；DiaAlk是基于二氮烯的炔烃探针，用于检测半胱氨酸磺酸（–SO₂H）。炔基可以通过点击化学连接到叠氮标签上以进行检测和富集。在哺乳动物细胞中，硫氧还蛋白可以降低过氧化物酶中的-SO₂H。线虫中不存在已知的硫氧还蛋白，而且-SO₂H可能是不可逆转的。氧化和还原过程分别用红色和蓝色箭头表示。
 图2 在秀丽隐杆线虫中定位高反应性半胱氨酸A.我们的定量化学蛋白质组工作流程示意图，用于对秀丽隐杆线虫蛋白质组中半胱氨酸的固有反应性进行位点特异性定量。在相同条件下收获的秀丽隐杆线虫裂解产物分别用10µM和100µM IPM标记，并用胰蛋白酶消化。通过CuAAC(也称为点击化学)，将IPM修饰的多肽与轻(10µM，红色)或重(100µM，蓝色)叠氮生物素试剂通过光解连接物(Az-UV-Biotin)连接。然后，将轻标记和重标记的样品等量混合，并进行基于链霉亲和素的富集。经过几个洗涤步骤后，在365nm的紫外光下选择性地将修饰后的多肽洗脱出来，用于基于LC-MS/MS的蛋白质组学分析。B.条形图显示了两个不同研究中量化半胱氨酸位点的数量，共同位点用黑色表示，不同位点用红色表示。C散点图显示两项研究中量化的半胱氨酸的R100：10值，而两项研究中R100：10值相似(相差小于1.5倍)的R100：10值以红色表示。D.来自UniProt数据库的功能注释条目之间的相关性，其中活性位点、二硫键或金属结合位点用红色表示，所有其他量化的半胱氨酸用黑色表示。功能注释条目的移动平均线以蓝色虚线显示。E-G.代表性提取离子色谱图(XIC)显示来自UBA-1(E)、活性位点以红色显示)、GSTO-1(F)和GPDs(G)的IPM标记肽的变化。轻标记肽和重标记肽的轮廓分别用红色和蓝色表示。

总之，通过鉴定3558个固有反应性半胱氨酸(R100：10≤6)，我们的发现极大地扩展了秀丽隐杆线虫反应性半胱氨酸蛋白质组的图谱。我们的分析表明，同一蛋白质中不同半胱氨酸的反应性可能存在显著差异，半胱氨酸残基的保守在一定程度上预测了它们的氧化还原反应性和可能的氧化还原调节功能。
2.秀丽隐杆线虫氧化敏感型半胱氨酸氧化还原形式的蛋白质组学研究
半胱氨酸的反应性是由其与亲电探针IPM的反应动力学决定的，这可能与其与ROS(如H₂O₂)的相互作用不完全一致。因此，固有的反应性可以在很大范围内预测半胱氨酸的功能，但不能直接显示其氧化还原调节的潜力。因此，我们接下来试图在蛋白质组的范围内直接评估秀丽隐杆线虫体内半胱氨酸的氧化还原敏感性。我们最近开发了以位点为中心的化学蛋白质组学方法，可以精确和定量地测量复杂蛋白质组中主要的调节半胱氨酸氧化还原形式。具体地说，化学选择性探针IPM、BTD和DiaAlk分别允许标记-SH、-SOH和SO₂H(图1)。为了定义与这些特定半胱氨酸形式有关的秀丽隐杆线虫氧化还原体，我们对野生型秀丽隐杆线虫的每个探针采用了这些既定的方法，并评估了5 mM H₂O₂处理5分钟后的变化(图3A),这样的处理避免了对蛋白质水平的显著干扰，但也允许检测半胱氨酸氧化的早期变化和对氧化最敏感的半胱氨酸残基，而不会影响动物的生存能力或行为。对于在这些分析中检测到的每个半胱氨酸，我们计算了处理/控制比率(RT/C)。硫醇被H₂O₂氧化会降低其对硫醇反应性探针IPM的可及性，因此较低的RT/C IPM表明半胱氨酸氧化增加。同时，H₂O₂诱导的S-磺酸或S-亚磺酸的形成会使更多的BTD或DiaAlk衍生的化学选择性结合，从而产生相对较高的RT/C BTD或RT/C DiaAlk值。我们总共定位和定量了2864个蛋白质上的5453个Cys-SH位点，1049个蛋白质上的1521个CysSOH位点，以及72个蛋白质上的82个Cys-SO₂H位点(图3B)。因为半胱氨酸的氧化是暂时的和可逆的，所以样品之间经常会观察到相对较大的数量差异。然而，值得注意的是，3301个半胱氨酸介导的氧化还原事件在一个以上的重复中被量化，中等CV值从8.4%到20.4%，证明了我们分析的重复性。我们的数据集包括许多已知受氧化还原调节和/或已在UniProt知识库中进行功能注释的半胱氨酸。由于点击蛋白质组学的随机性，造成了在一个重复实验中检测到许多半胱氨酸氧化还原形式，其中包括已知的活性或氧化还原敏感型半胱氨酸，这一结果表明，我们的数据集可以作为发现秀丽隐杆线虫重要氧化还原事件的有用资源，即使是“单次点击”也可能与生理相关。因为亚磺酰化是亚磺化的第一步(图1)，所以大约78%的亚磺酰化位点被鉴定为S-亚磺酰化也就不足为奇了。尽管有人认为，硫醇氧化成S-亚磺酸比S-亚砜转化为S-亚磺酸更容易发生，但我们发现，急性H₂O₂处理对许多半胱氨酸上的S-亚磺化反应比对S-亚磺化反应的影响更大(图3C)，例如，过氧化物诱导的亚磺化作用主要发生在蛋白质Y41D4A的C120上，Y41D4A是哺乳动物蛋白质酪氨酸磷酸酶非受体22(PTPN22)的同源基因，RT/C DiaAlk为7.01，而该半胱氨酸的-SH和-SOH形式变化温和(RT/C IPM=0.58，RT/C BTD=1.57)(图3D)。第二个例子是，GPD-3中活性中心C158的-SO₂H形式对H₂O₂处理非常敏感(RT/C DiaAlk=4.45)，而-SH和-SOH形式变化不大(RT/CIPM=0.52，RT/C BTD=1.35)(图3e)。C158S-亚磺化水平大幅上升的一个原因，可能是它不能形成二硫键，因为Sγ(158)亚基与最接近的Sγ(162)亚基之间的距离为约8.8(图3F)。一般说来，S-亚磺化的大动态范围可以部分归因于秀丽隐杆线虫中缺乏有效的S-亚磺酸还原系统，这使得半胱氨酸非常容易被过度氧化。此外，大量的亚磺化蛋白表明秀丽隐杆线虫的基础亚磺化水平可能很高，这也使得S-亚磺酸的过氧化更容易发生。图3 定义对氧化敏感的秀丽隐杆线虫氧化还原体A.我们的定量化学蛋白质组工作流程示意图，用于分析秀丽隐杆线虫在过氧化物处理后的半胱氨酸氧化还原形式。体外用化学选择性探针IPM(For-SH)、BTD(For-SOH)或DiaAlk(For–SO₂H)平行标记经(红色)或不经(蓝色)H₂O₂处理的秀丽隐杆线虫(图1)。探针标记的蛋白质组被加工成胰蛋白酶多肽，然后通过CuAAC与轻或重的Az-UV-生物素试剂反应。然后将轻标记和重标记的样品等量混合，用SCX清洗，并用链霉亲和素珠子富集。然后，标记的多肽被光释放，并进行基于LC-MS/MS的蛋白质组学分析，以鉴定和定量单个半胱氨酸残基。B.半胱氨酸氧化还原形式的对数变换RT/C值分布。C.热图显示了所有三个探针确定的半胱氨酸位点氧化还原形式的动态变化。显示Y41D4A.5(C120)(D)和GPD-3(C158)(E)探针标记多肽变化的代表性XICs。轻标记和重标记多肽的轮廓分别显示为红色和蓝色。根据两个生物复制计算的平均RT/C值显示在每个XIC的下方。F.显示C158亚基和C162亚基结构之间距离的正交同源线。G.一张饼状图，显示秀丽隐杆线虫氧化还原体中每种蛋白动态变化的半胱氨酸氧化还原形式的数量分布。H.本研究中确定的一组已知的氧化还原反应性代谢酶,功能信息从UniProt知识库中检索。

使用氧化还原蛋白质组学中的一个共同标准(RT/C IPM≤0.67，RT/C BTD≥1.5，或RT/C DiaAlk≥1.5)，在总共1537种蛋白质中，-SH、-SOH和-SO₂H位点在过氧化物处理后发生了显著变化(图3G)，其中-SH、-SOH和-SO₂H位点的比例分别为33.2%(1813/5453)、31.0%(472/1521)和93.9%(77/82)。我们认为这些位点包含对过氧化物敏感的氧化还原酶,这个大型的氧化还原体数据集包括一些已知的氧化还原敏感半胱氨酸，例如GPD-1中的C158(图3H)，40S核糖体蛋白RPS-17中的C35(补充数据3)，以及AGC家族激酶IRE-1中的C663(补充数据2)。然而，我们注意到我们的数据库不包括众所周知具有氧化还原活性的2-半胱氨酸过氧化还蛋白(如PRDX-2)中的过氧化(或催化)半胱氨酸。为了保持半胱氨酸的内在反应性，我们采用了自然的裂解条件，在这种条件下，PRDX-2中的过氧化半胱氨酸主要是二硫键连接的，因此不会被标记和检测。在我们的数据集中没有这种已知的氧化还原调节半胱氨酸,也可能归因于含有这个位点的疏水性胰蛋白酶多肽，而液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测中可能遗漏了这个位点。此外，半胱氨酸的氧化状态在空间和时间上都是受控制的，可能会受到蛋白质的亚细胞定位和活性氧水平的影响。这可能解释了为什么在我们的数据集中其他一些已知的氧化还原敏感位点没有过氧化物诱导的变化(图3H)。然而，重要的是，在我们的数据集中出现了大量已知的和新发现的氧化还原调节蛋白，这让我们对其覆盖范围和有效性充满信心。
3.半胱氨酸氧化还原修饰调控多种生物过程和途径
接下来，我们利用我们的氧化还原体数据来生成组织和细胞隔间的轮廓。正如预期的那样，氧化修饰蛋白在不同的组织和器官中表达，如肌肉和肠道。这些蛋白广泛分布在主要的细胞器中，包括线粒体、内质网和细胞核(图4A)。秀丽隐杆线虫氧化还原体的基因本体论(GO)和KEGG富集分析确定了无数重要的细胞过程,泛素-蛋白酶体途径代表一大类氧化反应蛋白(图4B),例如，在H₂O₂刺激下，E2泛素结合酶UBC-14的活性半胱氨酸C89上IPM的硫醇利用率显著降低(RT/C IPM=0.36)。几个代谢过程的富集，包括糖酵解、三羧酸循环(TCA)循环和戊糖磷酸途径(图4b和c)，这符合一个模型，即氧化还原敏感型代谢酶中的半胱氨酸修饰改变代谢通量，以恢复细胞氧化还原稳态。有趣的是，通过生物信息学分析，两条调控发育、生长和寿命的途径在氧化还原体中显著富集：mTOR蛋白复合体1(MTORC1)的机制靶点和胰岛素/IGF-1信号通路(图4B和图4C)。MTORC1复合物的两个核心成分，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶LET-363/mTOR(C848，RT/C IPM=0.65，图4D)和MLST-8(C263，RT/CIPM=0.59，)含有氧化敏感的半胱氨酸。此外，GTP酶RAGA-1在GTP/镁结合位点附近的GTP酶结构域中还含有一个过氧化物反应性半胱氨酸C167(RT/C IPM=0.66)，它在mTORC1激活的上游具有氨基酸感知功能，鉴定了秀丽隐杆线虫mTORC1信号通路中的氧化反应型半胱氨酸。秀丽隐杆线虫结合先前的证据表明，ROS影响哺乳动物细胞中的mTORC1信号，表明这一途径的氧化还原调节可能在进化上是保守的。胰岛素促进细胞膜H₂O₂的产生，胰岛素/IGF-1途径中的几种蛋白质受到半胱氨酸介导的氧化还原调节。转录因子DAF-16/Forkheadbox O(FOXO)是胰岛素的关键下游效应因子，DAF-16/FOXO与核受体IMB-2/Transportin-1之间的二硫键有助于其在ROS11存在下的核聚集。有趣的是，我们在DAF-16本身及其胰岛素/IGF-1信号通路的上游调节因子中检测到了额外的氧化敏感半胱氨酸残基，包括DAF-16中的C433(RT/C IPM=0.65，图4e)，DAF-2中的C1394(RT/CIPM=0.52)，以及DAF-18/PTEN中的C124(RT/CIPM=0.67)和C573(RT/C IPM=0.59)。DAF-2的C1394位于激酶活性位点D1388(UniProt)附近，而DAF-18的C124位于PTPs活性位点所特有的HCXXGXXR基序中。这些氧化修饰的半胱氨酸也可能有助于ROS诱导的DAF-16移位到细胞核中(图4f和g)。许多影响基因表达的蛋白质在氧化还原体中高度表达。组蛋白修饰酶通过控制染色质的可及性来影响转录活性，我们发现一些组蛋白修饰酶对氧化高度敏感，如组蛋白去乙酰化酶HDA-1和组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶MES-2，这表明它们可能在氧化应激时改变组蛋白修饰。前mRNA剪接在转录后调节基因表达，选择性剪接增加了mRNAs的多样性。在秀丽隐杆线虫氧化还原体中，我们还发现了RNA结合蛋白，包括依赖ATP的RNA解旋酶、富含丝氨酸和精氨酸(SR)的蛋白质以及其他剪接因子，这表明mRNA剪接和转录谱可能受到细胞氧化还原状态的调节。我们的GO项分析也表明蛋白质合成很可能受到氧化还原信号的广泛影响(图4B)。作为一种翻译调控机制，秀丽隐杆线虫和酵母菌表明，ROS通过促进eIF2α调控GCN2来抑制蛋白质的合成。在酵母中，在压力条件下,GCN2使eIF2α磷酸化需要GCN1的参与（图4H）。有趣的是，我们发现秀丽隐杆线虫中的GCN1同源基因在H₂O₂作用下被广泛氧化，定位了11个氧化剂敏感的半胱氨酸和4个磺酰化位点(图4I)。为了研究GCN-1在秀丽隐杆线虫GCN-2激活中的潜在作用，我们检测了野生型和GCN-1（n4827）动物中的eIF2α磷酸化水平。在GCN-1(α)动物中，野生型秀丽隐杆线虫在氧化条件下发生的eIF2−磷酸化水平的增加在很大程度上被减弱(图4J和k)。通过建立秀丽隐杆线虫对氧化应激反应中GCN-1的保守功能，我们的结果暗示GCN-1中的氧化还原活性半胱氨酸可能参与了GCN-2活性的氧化还原调节和可能的翻译启动。
4. 氧化还原敏感型半胱氨酸在抗氧化反应和病原菌抗性中对p38的活性起着至关重要的作用
通过进化保守的MAPK p38的信号被激活，以响应各种环境输入，包括病原体暴露和ROS信号。在秀丽隐杆线虫中，典型的p38MAPK信号级联由NSY-1(ASK1 MAPKKK)、SEK-1(MKK3/MKK6 MAPKK)和PMK-1(P38MAPK)(图5A)组成，PMK-1与相关激酶PMK-2和PMK-3以部分冗余的方式发挥作用。P38核心的下游效应因应激反应的不同而不同：如铜绿假单胞菌PA14，通过激活转录因子ATF-7，通过p38通路信号触发天然免疫程序，而氧化应激反应由PMK-1磷酸化转录因子SKN-1(NRF2)触发。我们的以位点为中心的蛋白质组学分析证实，在p38 MAPK通路中的两个ROS敏感蛋白中存在已知的氧化反应性半胱氨酸：跨膜ER激酶/RNase IRE-1和MAPKKK NSY-1/ASK1。有趣的是，我们还在这一途径中检测到另外两个氧化修饰蛋白：SEK-1和PMK-1(图5a和b)，因此，我们研究了这些新定位的半胱氨酸是否可能在p38 MAPK介导的胁迫反应和病原菌抗性中作为氧化还原开关。图4 半胱氨酸介导的氧化还原调节参与各种生物学过程和途径A.一张饼状图，显示了1537种蛋白质的分布，这些蛋白质至少显示了一种氧化还原敏感型半胱氨酸，它们在不同细胞器中的功能有关。秀丽隐杆线虫蛋白的亚细胞定位可以从UniProt知识库中检索到。由GO(B，蓝)和KEGG(C，红)分析表明，富含秀丽隐杆线虫氧化还原体的生物过程和途径。显示LET-363/mTOR(D)和DAF-16/FOXO(E)的IPM标记肽变化的代表性XIC。浅标记肽和重标记肽的轮廓分别以红色和蓝色表示。F.根据两个生物复制计算的平均RT/C值显示在单个XIC的下方。G.荧光图像和定量显示t-BOOH处理5h后DAF-16：GFP的细胞核聚集(Mean±SEM，n=3次实验，每个条件至少100条虫子)。**P=0.0100；标尺=100µm。H.示意图显示各种应力刺激促进eIF2a被GCN-2磷酸化。I.代表XICs显示来自GCN-1的IPM标记肽的变化。J.有代表性的Western blotts和定量;K.在GCN-1(−)动物(平均n=2个实验)中，t-BOOH暴露30min后，eIF2a磷酸化受到损害(平均n=2个实验)。

我们发现SEK-1(C213)中的一个普遍保守的半胱氨酸是值得特别关注的，因为它位于激酶激活环中，靠近镁结合的DFG基序(图5C)，这对蛋白激酶活性是至关重要的。为了研究C213对SEK-1功能的重要性，我们利用Cas9/CRISPR基因编辑技术在内源性SEK-1基因位点的C213位引入一个保守的半胱氨酸到丝氨酸突变，从而阻止SEK-1蛋白在该残基被氧化。重要的是，在这个氧化还原惰性突变体(SEK-1(Syb1398)，图5D中，p38直系物PMK-1的磷酸化显著减弱，表明氧化敏感的半胱氨酸C213对SEK-1激酶活性的基础水平是重要的。有趣的是，虽然H₂O₂或有机过氧化物叔丁基氢过氧化物(t-BOOH)显著提高了野生型动物的p38磷酸化水平，但在SEK-1突变体中，这种影响在很大程度上被减弱了(图5D)。抗氧化反应转录因子SKN-1的核定位和转录活性依赖于其被磷酸化的活性PMK-1磷酸化。与PMK-1活性降低一致，我们的SEK-1 CRISPR突变动物在生理和氧化条件下的SKN-1活性也较低，通过其目标GST-10的表达来衡量(图5F)。综上所述，这些观察表明，氧化还原敏感的半胱氨酸C213对SEK-1的活性至关重要。据报道，S-磺化事件可能增加酪氨酸激酶活性，我们的数据共同表明，C213上的S-磺基化也可能增强SEK-1激酶活性。图5 氧化敏感型半胱氨酸是p38激活所必需的A.秀丽隐杆线虫中的p38MAPK通路,在我们的分析中，粉红色的半胱氨酸被鉴定为对氧化还原敏感，而白色的半胱氨酸对H2O2处理没有反应;B.SEK-1(C213)和PMK-1(C173)IPM标记多肽变化的代表性XICs。轻标记肽和重标记肽的轮廓分别用红色和蓝色表示。根据两个生物复制计算的平均RT/C值显示在每个XIC的下方。C.SEK-1中的C213(红色)和PMK-1中的C173(红色)在进化上是保守的，位于靠近镁结合的DFG基序(蓝色)。D-E.野生型、SEK-1和PMK-1突变体动物携带各自的半胱氨酸到丝氨酸的突变，定量表明这两个半胱氨酸对于t-BOOH诱导的p38磷酸化都是重要的。F.用qRT-PCR定量检测野生型、PMK-1C173S突变体(PMK-1(Syb1415))和SEK-1C213S突变体(SEK-1(Syb1398))动物中SKN-1靶标GST-10的mRNA水平(均值，n=2个实验),PMK-1(−)(Km25)、SEK-1(−)(Km4)、PMK-1C173S(Syb1415)和SEK-1C213S(Syb1398)突变体。在铜绿假单胞菌PA14存在下，PMK-1(Km25)、SEK-1(Km25)(Km4)、PMK-1C173S(Syb1415)和SEK-1C213S(Syb1398)的生存曲线。
 PMK-1中氧化修饰的半胱氨酸C173在从秀丽隐杆线虫到人类的过程中显示出高度的保守性，并位于激酶激活环中镁结合的DFG基序附近(图5C)。免疫印迹显示，C173S突变(PMK-1(Syb1415))在很大程度上抑制了PMK-1的磷酸化(图5e)，而不影响PMK-1的丰度。重要的是，在基础和氧化应激条件下，PMK-1(Syb1415)突变体的PMK-1磷酸化水平和可能的活性都低于野生型动物，这意味着C173对于SEK-1的PMK-1磷酸化和一般的PMK-1活性是重要的(图5e，f)。综上所述，这些数据表明，p38通路中的氧化还原反应性半胱氨酸对于基础p38活性和ROS激活p38是至关重要的。在确定SEK-1和PMK-1中的半胱氨酸对p38活性至关重要之后，我们接下来研究同样的半胱氨酸是否在p38介导的免疫应答中起重要作用。我们评估了野生型、SEK-1和PMK-1突变动物感染PA14细菌后的存活率。与以前的报告一致，推测的零突变体PMK-1(Km25)(PMK-1(−))和SEK-1(Km4)(SEK-1(−))对PA14感染的易感性增加，其中SEK-1(−)突变体表现出比PMK-1(-)动物更严重的缺陷(图5G)。这与PMK-1可能以部分冗余的方式发挥作用的证据是一致的，在病原体应答中，PMK-2与其平行的PMK-2在SEK-1下游。SEK-1C213S突变增加了病原体的敏感性，尽管程度低于SEK-1零突变(图5G)，这表明保守地替代这个SEK-1残基导致了天然免疫功能的部分丧失。相比之下，PMK-1(Syb1415)动物在PA14存活方面的表现与野生型相似(图5G)，这一发现可能反映了PMK-1和-2之间的功能冗余，或者C173对PMK-1在PA14抗性中的功能不是必不可少的。综上所述，我们得出结论：保守的氨基酸PMK-1C173和SEK-1C213对氧化应激激活p38都是重要的，而后者也是病原菌防御的关键。我们的发现表明，这两种半胱氨酸转导应激信号来激活p38意味着，氧化还原调节不仅发生在两个已知的氧化还原传感器IRE-1和NSY-1上，而且确实发生在p38通路的每个组成部分上。

讨论

对蛋白质氧化还原体的全面评估对于理解细胞和生物体中氧化还原信号网络的范围，以及建立氧化还原调控如何作用于特定的调控途径和生物过程的模型至关重要。近年来，氧化还原蛋白质组学领域取得了很大的进展，细胞和组织的研究已经能够检测到数以千计的活性氧反应性半胱氨酸。然而，在多细胞模式生物中定义氧化还原体的进展还没有跟上，在秀丽隐杆线虫或黑腹秀丽隐杆线虫中确定的氧化还原修饰位点的规模仍在百分之一。如此大的差距很可能反映了检测灵敏度和检测能力的差异，并表明需要在生物体水平上全面表征氧化还原体。秀丽隐杆线虫是研究氧化还原信号标记的强大模型,它的寿命也相对较短（约3周，苍蝇约3个月，小鼠约3年），基因组已完全测序，并且蛋白质组中包含许多保守的半胱氨酸,与使用细胞培养模型进行的研究相比，用于遗传操纵的各种工具可以研究体内选择性半胱氨酸的生理功能。在这里，我们已经在蛋白质组学规模上对秀丽隐杆线虫的内在半胱氨酸反应性进行了定量分析，为将来对生理学相关的氧化还原事件进行功能筛选提供了基础。此外，在急性过氧化氢处理下，秀丽隐杆线虫中三种特定的氧化还原形式（–SH，–SOH和–SO₂H）已通过系统和特定的比例变化进行了测量,总共确定和定量了5453 –SH，1521 –SOH和82 –SO₂H位点，包括先前确定为氧化还原调节的许多半胱氨酸（图3）。此外，通过鉴定许多新颖的氧化还原调节的半胱氨酸和蛋白质，我们的结果显着增加了秀丽隐杆线虫氧化还原数据的规模。以前的许多氧化还原蛋白质组学研究都集中在定量测定硫醇上的总可逆氧化。在细胞内，硫醇会经历各种氧化修饰，包括–SOH，–SO₂H和–SS–，这可能会对蛋白质活性产生不同的影响,例如，有证据支持帕金森氏病蛋白DJ-1的C106上的亚磺酰基保护细胞，而同一半胱氨酸上的亚磺酰基则不能保护细胞。通过同时表征半胱氨酸的还原形式和氧化形式，我们的研究定义了秀丽隐杆线虫中许多不同的氧化事件的性质。我们鉴定了1537种蛋白质，其中至少一种半胱氨酸氧化还原形式经氧化剂处理后发生了显着变化（≥1.5倍）。PTM（例如磷酸化和乙酰化）可能不需要达到很高的化学计量即可发挥调节作用，我们预计在许多情况下，半胱氨酸氧化还原状态的倍数变化程度可能与绝对百分比修饰值一样有意义。对于半胱氨酸和蛋白质，我们的发现为已知的氧化还原调节的生物过程提供了潜在的机制洞察力。例如，我们在mTORC1信号和胰岛素/IGF-1信号通路中发现了几个过氧化物敏感的位点，因为内源ROS水平在秀丽隐杆线虫的早期发育过程中和整个生命周期中都有很大的波动。作为第二个例子，在氧化条件下观察到从酵母到哺乳动物细胞的整体翻译抑制,翻译调节因子eIF2α被保守的蛋白激酶GCN-2磷酸化，但ROS信号如何传递给GCN-2尚不清楚。虽然ROS可能增加GCN-1蛋白水平，从而促进eIF2α被GCN-2磷酸化，但另一种可能性是ROS直接调节GCN-1活性,我们发现GCN-2辅因子GCN-1含有11个氧化修饰的半胱氨酸，并参与秀丽隐杆线虫体内ROS诱导eif2α磷酸化的过程，暗示它可能是一种重要的氧化还原感受器，响应环境变化，调节蛋白质合成。我们还在翻译起始、延伸和终止因子以及核糖体蛋白中发现了许多氧化还原敏感的半胱氨酸，这表明氧化应激下蛋白质合成减少可能在翻译的多个步骤中受到控制。基因表达模式受转录因子、表观遗传因子和mRNA剪接因子的协调。在氧化条件下，序列特异性转录因子如SKN-1/NRF和DAF-16/FOXO的激活改变了靶基因的表达水平。最近有报道ROS修饰SET-1/MLL1组蛋白甲基转移酶，从而降低全球H3K4me3水平。我们在秀丽隐杆线虫氧化还原体中发现了额外的染色质修饰酶，这表明其他表观遗传标记的潜在变化也可能发生,剪接因子受到翻译后修饰，如磷酸化和乙酰化，这会影响它们的定位和活性。尽管以前没有发现前mRNA剪接与氧化还原信号有关，但在这项研究中，我们确定了剪接的几个调控因子作为明显的ROS靶标。综上所述，我们的分析表明，基因表达和mRNA水平的氧化还原调节很可能在转录和转录后水平上实现。我们确定为氧化还原修饰的SEK-1和PMK-1中的半胱氨酸对于p38磷酸化和激活均很重要，将该途径对p38信号的氧化还原调节进行表征（图5）。鉴于氧化修饰可以改变蛋白质构象或配体结合亲和力，我们发现是SEK-1和PMK-1中的半胱氨酸氧化可能促进SEK-1和PMK-1之间的相互作用，从而增加PMK-1的磷酸化水平。氧化也可能通过其他机制（例如蛋白质稳定性或亚细胞定位）增强SEK-1激酶活性。我们的结果表明，整个p38 MAPK信号级联反应的氧化和激活可能发生在ER膜附近，在激活过程中NSY-1被定位。在哺乳动物的先天免疫反应中，ROS产生的增加激活了吞噬细胞内的各种适应机制，从而有助于消除病原体。在秀丽隐杆线虫中，病原体暴露导致NADPH氧化酶BLI-3产生ROS，从而激活p38MAPK信号，这是一种古老而保守的免疫反应机制。我们发现，SEK-1激酶激活环中保守的半胱氨酸的氧化对秀丽隐杆线虫的病原体防御是必不可少的(图5)，这表明氧化还原信号在涉及p38信号的病原体抗性中发挥了作用。这样的观察还表明，半胱氨酸的翻译后氧化除了在氧化应激防御之外，还在应激中发挥着更广泛的作用。鉴于我们在SEK-1和PMK-1中发现的重要的氧化还原调节半胱氨酸是保守的(图5)，未来在更复杂的生物体中探索单个信号成分的氧化还原调节如何在不同刺激和不同细胞类型中影响p38通路的激活将是重要的。综上所述，我们的半胱氨酸内在反应性的定量、位点中心图和过氧化敏感半胱氨酸氧化还原形式的数据集极大地扩展了秀丽隐杆线虫半胱氨酸氧化的范围和生物学作用，并为破解模式生物中复杂的氧化还原信号网络提供了分子基础。这将刺激未来的研究，以揭示秀丽隐杆线虫和其他保存半胱氨酸的生物体中个体半胱氨酸的生物学意义。随着细胞氧化还原状态和半胱氨酸修饰事件在衰老和几种疾病中的改变，了解生理和病理条件下致病蛋白的半胱氨酸氧化还原谱和氧化还原状态也可能为潜在的治疗策略提供洞察力。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33658510/

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