科研 | Cell Death Dis：神经胶质瘤干细胞对酸中毒应激反应中的嘌呤代谢重组

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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

胶质瘤干细胞（glycoma stem cells，GSCs）是导致胶质瘤患者治疗耐药和预后不良的重要因素。GSCs的一个显著特征是能够在酸性微环境中生长。然而，在低pH条件下，它们的代谢重组的机制仍然是难以捉摸的。在这里，利用代谢组学和代谢通量方法，我们在pH6.8和pH7.4培养GSCs，发现在低pH条件下培养的细胞表现出更高的从头嘌呤核苷酸生物合成活性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（由G6PD或H6PD编码）的过表达通过增强戊糖磷酸途径（PPP）支持GSCs在酸性条件下培养时对核苷酸的代谢依赖性，酸性条件下高水平的还原型谷胱甘肽（GSH）也导致对PPP提供NADPH的需求。综上所述，PPP中G6PD/H6PD的上调在酸性驱动嘌呤代谢重编程中起重要作用，并使其倾向于胶质瘤的进展。我们的研究结果表明，靶向G6PD/H6PD与胶质瘤患者的生存密切相关，可以作为胶质母细胞瘤的一个有前途的治疗靶点。综合代谢组学和代谢通量分析，以及考虑微环境和肿瘤干细胞，为理解癌症代谢重编程提供了一个精确的视角。

论文ID

原名：Rewiring of purine metabolism in response to acidosis stress in glioma stem cells译名：神经胶质瘤干细胞对酸中毒应激反应中的嘌呤代谢重组
期刊：Cell Death Disease
IF：6.304发表时间：2021.03通讯作者：彭小忠，Zeper Abliz
通讯作者单位：中国医学科学院北京协和医学院

实验设计

1. 在酸性和正常生长条件下对GSC2进行代谢组学和靶向代谢组学分析；

2. 使用¹³C₆葡萄糖作为示踪剂进行代谢流量分析，以检测在pH 6.8和pH 7.4培养的GSC2的TCA循环；

3. 使用¹³C₆葡萄糖作为示踪剂进行代谢通量分析，以检测在pH6.8和pH7.4培养的GSC2中葡萄糖衍生碳原子的代谢；

4. GSEA分析GSC2在不同pH条件下的基因表达数据；

5. 使用网络工具GEPIA比较胶质瘤患者组和对照组中这些酶的表达水平。

实验结果

1. 酸中毒应激下嘌呤和嘧啶代谢上调
为了解酸中毒如何改变GSC的代谢表型，我们在酸性和正常生长条件下对GSC2进行了代谢组学和靶向代谢组学分析。我们先前确定GSC在6.8的酸性pH下生长最佳。因此，在本研究中，pH6.8和7.4被确定为酸性和正常条件。OPLSDA和投影分析中的变量重要性揭示了一组代谢物，它们区分在pH6.8和pH7.4培养的GSC2。基于VIP值>2的阈值、独立t检验（p<0.05）和至少1.2的强度倍数变化（图S1），我们共鉴定了74种在两种pH条件下具有统计显著差异的代谢物。另一组独立的细胞样本用于随后的目标代谢组学分析，并产生了51种经进一步验证的差异代谢物（图1a和S2以及表S3）。与pH7.4相比，在pH6.8培养的GSC2中，41种代谢物的丰度增加，10种代谢物的丰度减少。此外，对51种差异代谢物的代谢途径分析表明，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及嘧啶代谢等发生了深刻的变化。图1b显示了显著改变的途径（途径影响>0.1）。伴随着谷胱甘肽代谢中GSH/GSSH中间产物的高比率（γ-谷氨酸-半胱氨酸、半胱氨酸-甘氨酸、亚精胺和L-谷氨酸）在酸性条件下在GSC2中累积（图S3）。在酸性条件下培养的GSC2中，核苷酸、核苷和碱基（包括9种嘌呤代谢物和6种嘧啶代谢物）也显著增加（图1c，d）。图1 酸中毒应激反应中嘌呤和嘧啶代谢的上调。a pH6.8和pH7.4培养的GSC2的代谢组学比较。b pH值为6.8时显著变化（p<0.05，双尾Student's t检验）代谢物的b通路分析。c 通过LC-MS测定GSC2中嘌呤代谢物显著变化的相对丰度（**p<0.01）。d 通过LC–MS测定GSC2中嘧啶代谢物显著改变的相对丰度（**p<0.01）。
 2. 在酸性微环境中增加能量代谢
为了确定低pH对能量代谢相关途径的影响，我们使用¹³C₆葡萄糖作为示踪剂进行代谢流量分析，以检测在pH 6.8和pH 7.4培养的GSC2的TCA循环。来自能量代谢相关途径的中间体的丰度显著增加，包括柠檬酸盐/异柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐和琥珀酸盐（图S7）。在厌氧糖酵解中，¹³C₆葡萄糖生成丙酮酸（m+3）并进一步形成乳酸（m+2）。丙酮酸（m+3）可以通过丙酮酸脱氢酶（PDH）生成乙酰辅酶A（m+2），它与草酰乙酸（OAA）结合生成TCA循环的¹³C₂标记中间体（图2a）。相反，丙酮酸羧化酶（PCB）将丙酮酸（m+3）与未标记的CO₂羧化，形成OAA（m+3），OAA与未标记或¹³C₂标记的乙酰辅酶A结合生成柠檬酸盐（m+3）或柠檬酸盐（m+5）以及其他标记的TCA循环中间产物（图2b），通过PDH和PCB产生的可能标记代谢物分别如图2a和b所示。值得注意的是，在pH6.8处理的GSC2中观察到TCA循环通量升高，与CIT/ISO（m+2，m+3，m+5）、α-KG（m+2，m+4）、SUC（m+2，m+4）和MAL（m+2，m+4）的¹³C₆-葡萄糖标记一致（图2c-e）。此外，经pH 6.8处理的GSC2中2-HG（m+2，m+4）的分数也增加（图2c，d）。 图2 在酸性微环境中增加能量代谢。a，b ¹³C₆标记葡萄糖通过TCA循环的示意图。仅显示可能的标记代谢物的子集。白圈：¹²C；橙圈、绿圈：¹³C分别来源于PDH-和PCB介导的Krebs循环反应。c–e 在pH6.8和pH7.4培养的GSC2中TCA循环中代谢物的百分比（%）。
 3. 基于代谢通量分析的酸性微环境对从头核苷酸生物合成的影响
为了确定酸性微环境对从头核苷酸生物合成通量的影响，我们使用¹³C₆葡萄糖作为示踪剂进行代谢通量分析，以检测在pH6.8和pH7.4培养的GSC2中葡萄糖衍生碳原子的代谢。葡萄糖碳通过PPP转化为R5P后可以整合到核苷酸中（图3a）。我们用LC-MS测定IMP、XMP、AMP、GMP、CMP、UMP及其衍生物的同位素分布。结果显示，除GMP外，pH6.8培养的GSC2比pH7.4培养的GSC2更有效地将标签整合到嘌呤核苷酸中；而pH7.4培养的GSC2比pH 6.8培养的GSC2更能有效地将标签整合到嘧啶中（图3b-d）。IMP、XMP、AMP及其衍生物ADP、ATP、肌苷和黄嘌呤的高¹³C标记（m+5）组分表明GSC2在酸中毒时优先利用R5P支持从头嘌呤核苷酸的生物合成。相反，在酸性条件下，嘧啶的合成通量没有增加。 图3 pH6.8处理的GSC具有利用葡萄糖衍生碳的高从头嘌呤核苷酸生物合成率。a 葡萄糖碳代谢同化为核苷酸生物合成的示意图。b–d pH6.8和pH7.4培养的GSC2中嘌呤和嘧啶代谢物的百分比（%）。
 接下来，我们通过测量¹⁵N₂谷氨酰胺与嘌呤和嘧啶核苷酸结合的¹⁵N，研究了低pH值对核苷酸生物合成速率的影响。标记的谷氨酰胺与嘌呤核苷酸结合形成IMP（m+2）、XMP（m+2）、AMP（m+2）和GMP（m+3）。相反，谷氨酰胺的标记胺可被（m+1）标记形式的嘌呤核苷酸同化（图4a）。对于嘧啶核苷酸，谷氨酰胺的¹⁵N-酰胺标记的UMP和CMP分别具有一个¹⁵N原子和两个¹⁵N原子。谷氨酰胺的¹⁵N胺，用一个¹⁵N原子标记天冬氨酸。随后，标记的天冬氨酸可整合到产生UMP（m+1）和CMP（m+1）的嘧啶核苷酸中（图4b）。本实验以¹⁵N₂谷氨酰胺为示踪剂，对¹⁵N胺和¹⁵N酰胺进行了鉴别。在酸性条件下生长的GSC2细胞具有较高比例的（m+2）形式的IMP、XMP和AMP以及（m+3）形式的GMP（图4c）。然而，在酸性条件下，IMP（m+3）、XMP（m+3）、AMP（m+3）和GMP（m+4）的标记部分被还原（图4d）。对于嘧啶核苷酸，在低pH处理的GSC2中，（m+1）形式的天冬氨酸、UMP和CMP以及（m+2）形式的CMP的分数显著增加（图4e）。相反，在pH 6.8处理的GSC2中，UMP（m+2）和CMP（m+3）的部分减少（图4f）。嘌呤和嘧啶核苷酸的标记形式和组分可能表明，在低pH条件下，GSC2中谷氨酰胺富含酰胺氮，而不是胺氮。图4 谷氨酰胺氮在核苷酸生物合成中的利用。a-b 一个谷氨酰胺氮代谢同化嘌呤核苷酸生物合成和谷氨酰胺氮代谢同化嘧啶核苷酸生物合成的示意图。c–f 在pH6.8和pH7.4培养的GSC2中核苷酸和天冬氨酸的百分比（%）。
 4. 酸中毒应激增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达
我们分析了GSC2在不同pH条件下的基因表达数据。与我们的代谢组学分析结果一致，基因集富集分析（GSEA）表明，pH6.8处理的GSC2显著影响嘌呤代谢途径（图5a）。途径富集分析还表明，嘌呤代谢途径在酸性条件下显著富集（图5b）。为了进一步探讨嘌呤核苷酸在GSC中的关键作用，我们检测了嘌呤核苷酸处理的GSC2中干细胞标记物的表达。Western blot分析表明，在GSC2培养基中添加AMP、GMP、XMP和IMP可促进干细胞标记物的表达（图5c）。尽管参与从头嘌呤合成和补救合成的关键酶的蛋白表达水平在酸性条件下没有显著上调（图5d，e），但在GSC2中，PPP中H6PD和G6PD的蛋白表达水平增加（图5f），并且在酸性处理的GSC2中，干细胞标记物的表达水平增加，这与我们之前的研究一致。此外，我们还添加了另外两条GSC线（T2-4和T12-1）。T2-4和T12-1的结果与GSC2一致（图5g，h），然而，在LN229分化的胶质瘤细胞中没有发现相同的结果（图5i）。总之，这些结果表明，在酸性条件下，G6PD和H6PD可能在GSCs的代谢重塑中起重要作用，但在分化的胶质瘤细胞中不起作用。我们使用网络工具GEPIA比较了这些酶在胶质瘤患者组和对照组之间的表达水平。人脑胶质瘤患者H6PD、G6PD、ADSL、APRT、GMPS、PRPS1和IMPDH1的基因表达水平显著高于对照组（图5j，k和S8）。为了确定嘌呤生物合成的临床相关性，我们分析了嘌呤合成酶的表达与患者预后之间的关系。结果显示，H6PD、ADSSL1、ADSS和IMPDH1的高表达与胶质母细胞瘤患者的预后不良相关（图5l，m，S9和S10）。图5 酸中毒增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达，为核苷酸生物合成提供核糖-5-磷酸酯。a 基因集富集分析揭示了低pH处理GSC2对嘌呤代谢的影响。b 酸中毒的途径富集分析（前30名）。c 暴露于嘌呤核苷酸代谢物48小时的GSC2中干细胞标记物的表达。d 代表戊糖磷酸途径（PPP）和从头嘌呤核苷酸合成中的主要酶和代谢物。e 代表PPP和嘌呤核苷酸合成中主要酶的示意图。f–i 在pH6.8或pH7.4处理条件下，对GSC2、T2-4、T12-1和LN229中上述主要酶的表达进行Western blot分析。j, k 使用网络工具GEPIA检测低级别胶质瘤（LGG）和胶质母细胞瘤（GBM）标本中H6PD和G6PD的表达水平。（***p<0.001）。l, m 基于肿瘤基因组图谱（TCGA）数据集的胶质母细胞瘤患者H6PD和G6PD表达的生存率分析。
 图6 酸中毒应激下GSCs代谢重组模型。在酸中毒胁迫下，GSCs表现出增加的从头嘌呤核苷酸生物合成途径，该途径受葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的调控。G6PD/H6PD的过度表达通过增强磷酸戊糖途径（PPP）支持GSCs对核苷酸的代谢依赖性。同时，TCA循环流量也增加，这为酸性条件下GSCs线粒体代谢的重要性提供了支持。这种由酸中毒驱动的GSCs代谢的重新编程表明靶向G6PD/H6PD可能是改善胶质母细胞瘤治疗的一个有前途的治疗靶点。

讨论

我们先前的研究结果表明，在酸性微环境中，GSCs的ATP生成和线粒体活性增加，表明OXPHOS水平较高。因此，在本研究中，我们重点分析了线粒体TCA循环，它是能量代谢的中枢。TCA循环可以产生还原当量，包括NADH和FADH2，它们被转移到线粒体电子传递链以促进氧磷产生能量。我们发现TCA循环流量增加，进一步支持了酸性条件下GSCs线粒体代谢的重要性。尽管先前对Warburg的观察表明癌细胞中存在糖酵解表型和线粒体OXPHOS的永久性损伤，但最近的研究提供了一个更深入的理解，即某些癌症中的能量代谢超出了Warburg效应，存在完整的线粒体OXPHOS。Wheaton等人进行的研究揭示了线粒体对癌细胞存活、生长和增殖的重要性，以及利用线粒体作为治疗靶点的潜力。利用非靶向和靶向代谢组学方法，我们发现在酸性微环境中GSCs中嘌呤、嘧啶和谷胱甘肽的代谢水平升高。在核苷酸代谢中，包括嘌呤代谢和嘧啶代谢，在酸性条件下，碱基、核苷和核苷酸的含量均高于正常条件下。由于碱基和核苷是核苷酸降解的产物，在低pH处理的GSCs中，它们的水平升高，削弱了高水平的IMP、XMP、AMP、GMP和UMP，这是由于核苷酸降解受阻所致。这一发现表明，DNA复制和RNA产生所需的核苷酸可能在细胞对酸中毒的反应中起关键作用。最近的一项研究表明，从头嘌呤的合成促进了GBM细胞的抗辐射能力。由于肿瘤内基因组的异质性，我们难以设计个性化的靶向治疗；然而，代谢变化往往是相同的，例如嘌呤代谢暗示靶向治疗的新思路（特别是对于具有基因组异质性的癌症）。我们的代谢通量分析结果也揭示了在低pH条件下，葡萄糖在嘌呤生物合成中的高利用率。通量数据表明，酸中毒通过PPP驱动葡萄糖碳产生R5P，从而提供具有糖骨架的嘌呤核苷酸。出乎意料的是，结果表明，酸性条件并没有促进葡萄糖碳在嘧啶核苷酸中的掺入增加。这一结果强调了低pH处理的GSCs中从头嘌呤核苷酸生物合成的上调。此外，谷氨酰胺氮标记后核苷酸的标记形式和组分的结果可能表明，酸中毒促进酰胺氮而不是胺氮的同化，从而促进核苷酸生物合成。然而，为了证实这一观点，还需要使用¹⁵N酰胺谷氨酰胺和¹⁵N胺谷氨酰胺作为示踪剂进行额外的代谢通量分析。基因表达微阵列数据集的GSEA也显示在pH6.8处理的GSCs中与嘌呤代谢相关的基因集显著富集，这支持了我们在代谢水平上的发现。Western blot结果证实，嘌呤核苷酸，包括IMP、XMP、GMP和AMP，有助于维持GSCs在酸性微环境中的稳定性。Wang等人的整体代谢组学和基因组分析证明胶质瘤起始细胞依赖于从头嘌呤合成，以及嘌呤合成酶水平的增加。然而，在我们的研究中，参与从头嘌呤核苷酸合成和补救嘌呤合成的酶的蛋白表达水平在酸性条件下没有显著上调。我们推测这一结果可能是嘌呤核苷酸合成上游其他酶表达变化的结果。作为糖酵解第一步的一个分支，PPP通过向细胞提供核糖-5-磷酸以进行从头核苷酸生物合成和NADPH以调节GSH水平，在维持肿瘤细胞生长中发挥关键作用。我们的结果揭示了酸性微环境和GSC中GSH代谢上调之间的相互作用。总之，GSH和嘌呤核苷酸的上调表明，在酸性条件下，GSCs的代谢重编程可能是由PPP的上调引起的。与此一致，在pH6.8培养的GSCs中，PPP的关键酶葡萄糖-6磷酸脱氢酶的表达水平增加。Zhang等人发现G6PD介导的细胞抗氧化防御和核苷酸生成的上调导致小鼠和人类细胞中的致瘤转化。许多研究表明，G6PD或H6PD的异常激活与快速生长的癌细胞的成瘤和恶性肿瘤有关。研究还发现，H6PD的下调可以影响结肠癌和乳腺癌细胞的增殖和迁移。药物、放疗和化疗耐药性与多种癌细胞中高水平的GSH、核苷酸和活化的PPP相关。这些发现暗示，直接抑制上游PPP破坏氧化还原稳态，阻断核苷酸合成，从而选择性地清除癌细胞是可能的。PPP第二种酶的抑制剂，是2-脱氧-D-葡萄糖、葡萄糖类似物和6-氨基烟酰胺的组合，已被证明可增强人脑胶质瘤的放射敏感性。这些发现暗示GSCs对G6PD和H6PD的抑制可能是敏感的。通过对TCGA和中国胶质瘤基因组图谱中相关基因的分析，我们发现胶质瘤患者中编码葡萄糖-6磷酸脱氢酶的两个基因G6PD和H6PD的表达增加，尤其是H6PD。此外，我们发现H6PD而不是G6PD与胶质母细胞瘤患者的低生存率相关。然而，酸性微环境下GSCs中G6PD、H6PD与嘌呤代谢的关系尚需进一步研究。此外，新的研究表明，胶质母细胞瘤的代谢改变可能导致免疫抑制，从而代表了一系列的代谢免疫检查点。色氨酸代谢异常是胶质母细胞瘤的一个重要代谢节点和免疫检查点，许多研究发现，靶向此途径的限速酶吲哚胺2,3-双加氧酶1可以通过减轻免疫抑制来提高治疗效果。酸性微环境通过影响肿瘤免疫监视的各个组成部分，在免疫调节和癌症进展中起着促进作用。暴露于低pH环境会导致NK和T细胞等抗肿瘤效应物的功能障碍以及调节性T细胞和髓样细胞等免疫抑制成分的激活。因此，我们认为酸中毒引起的GSCs代谢重构的逆转，特别是通过靶向限速酶G6PD或H6PD，可能消除免疫抑制作用。综上所述，我们的工作描述了GSC在酸性微环境中的代谢重组模型，该模型主要由PPP介导，PPP上调嘌呤核苷酸生物合成并增加GSH水平（图6）。尽管还需要进一步的研究，但目前的研究表明，靶向pH传感通路是抗GSC治疗的一种有前途的方法。关键代谢酶，如H6PD或G6PD，可能是改善神经胶质瘤患者免疫治疗和预后的潜在靶点。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33723244/‍

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