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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读铁蛋白是细胞内主要的铁储存蛋白，是铁稳态和解毒所必需的。Cd通过复杂的机制影响细胞内稳态并诱导细胞毒性。本研究旨在探讨可口革囊星虫铁蛋白(PeFer)对Cd(II)诱导的骨髓间充质干细胞(BMSC)损伤的细胞保护作用机制。我们采用流式细胞术分析不同治疗组对细胞凋亡和细胞周期的影响，然后我们进一步利用基于2-DE的蛋白质组学和1H-NMR代谢组学图谱研究了三组的改变。结果表明，PeFer能降低Cd(II)诱导的BMSC凋亡，延缓G0/G1细胞周期进程。三组BMSC样本中共有19种蛋白质和70种代谢物存在显著差异。值得注意的是，多组分析显示，Cd(Ⅱ)可能干扰ER应激介导的细胞凋亡途径，破坏TCA循环、氨基酸代谢、嘌呤和嘧啶代谢等生物学过程，从而抑制细胞生长速度，启动细胞凋亡，而PeFer的加入可能通过增强能量代谢来保护BMSCs抵抗细胞凋亡，从而提高细胞存活率。本研究为更好地了解BMSCs中PeFer对Cd(Ⅱ)损伤保护作用的潜在分子机制提供了依据。
论文ID
原名：Integrative proteomics and metabolomics profiling of the protective effects of Phascolosoma esculent ferritin on BMSCs in Cd(II) injury译名：整合蛋白质组学和代谢组学分析可口革囊星虫铁蛋白对Cd（II）损伤BMSCs的保护作用
期刊： Immunology Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872发表时间：2021.04通讯作者：苏秀榕
通讯作者单位：宁波大学
实验设计
1. 重组铁蛋白在含有重组质粒pET-28a-PeFer的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达，纯化后的蛋白经SDS-PAGE鉴定并利用ICP-MS测定Cd含量；
2. 体外细胞实验评价PeFer对Cd(Ⅱ)诱导BMSC损伤的细胞保护作用；
3. 采用2-DE凝胶进行蛋白质质组学分析，并根据分子功能、细胞成分和生物学过程对GO进行分类，以了解PeFer保护BMSC免受Cd(Ⅱ)损伤的蛋白质变化；
4. 基于NMR谱进行代谢组学分析，以了解PeFer对Cd(Ⅱ)诱导BMSC损伤细胞保护作用的代谢机制。
实验结果
1.重组PeFer的表达、纯化和鉴定
重组铁蛋白在含有重组质粒pET-28a-PeFer的大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)中表达，纯化后的蛋白经SDS-PAGE鉴定(图1A)。重组PeFer的分子量与预测的大小一致，表明无N端6×His标签的PeFer分子量约为20kDa(图1A，泳道10)。ICPMS结果表明，PeFer对Cd(Ⅱ)的螯合能力显著高于天然HoSF，最大含量分别为16.74±1.05和0.57±0.11mM/g(图1B)。CD光谱分析表明，PeFer(PeFer-CdII)和HoSF(HoSF-CdII)富集Cd(Ⅱ)前后蛋白质的构象保持了近似恒定，在198nm左右达到极大值，在209nm和223nm左右达到极小值(图1C和D)。此外，如图S1C所示，在PeFer-CdII中富集后，PeFer的SEM图像呈现棉状结构，而HoSF-CdII中的PeFer则呈现一定的分散棉状结构(图S1D)。EDS图谱证实了PeFer和HoSF暴露于Cd(Ⅱ)时3.1keV处存在Cd峰，而未经Cd(Ⅱ)处理的铁蛋白中未检测到Cd(图S2)。AFM图像高度剖面分析表明，PeFer的高度为1.81±0.46nm(图S3A)，低于HoSF的高度为2.28±0.35nm(图S3B)。而Cd处理后，PeFer-CdII的高度为7.90±0.73nm(图S3C)，HoSF-CdII的高度为9.60±1.22nm(图S3D)。
图1 PeFer的制备与表征。(A)重组PeFer的表达与纯化。泳道1：中间分子标记；泳道24：非诱导的pET-28a-PeFer的总蛋白；泳道57:IPTG诱导的pET-28a-PeFer的总蛋白2,3和4小时；泳道89:IPTG诱导pET-28a-PeFer总蛋白6小时；泳道10：不含His标签的pET-28a-PeFer纯化蛋白。(B)通过ICP-MS测定Cd含量；数据描述为平均SD(n=3)。与HoSF组相比，*P<0.05。(C)用CD(II)处理的PeFer的CD光谱；(D)用CD(II)处理的HoSF的CD光谱。
2.PeFer对Cd(II)诱导骨髓间充质干细胞损伤的保护作用
体外细胞实验评价PeFer对Cd(Ⅱ)诱导BMSC损伤的细胞保护作用。随着CdCl2浓度的增加，吸光度值不断降低，抑制率增加(图S4)，表明Cd(Ⅱ)的存在显著抑制了BMSCs的增殖。我们采用SPSS软件进行Probit分析，结果表明，20 μM CdCl2对小鼠的50%抑制浓度(IC50)为24 h。BMSCs形态显微照片显示，对照组细胞呈长梭形，相互黏附(图2A和D)；模型组和蛋白组细胞收缩成小球，模型组更明显(图2B和E，图2C和F)。透射电镜分析显示，对照组细胞核完整，核膜清晰，模型组可见细胞核畸变和变形，线粒体皱缩和自噬(图2G-L)。而对照组和蛋白组细胞核基本完整，蛋白组未见明显病变(图2I和L)。为探讨Cd(Ⅱ)对BMSC存活的功能影响，我们在不同时间段测定3组细胞凋亡情况(图S5)。如Fig3A所示，随着孵育时间的延长，对照组细胞凋亡率无明显变化，而模型组和蛋白组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。此外，凋亡率的差距逐渐增大。孵育24h后，模型组细胞凋亡率增加至22.45-0.76%，而蛋白组仅增加到15.65-2.47%(图S5)。为阐明Cd(Ⅱ)诱导BMSC生长抑制的机制，我们采用流式细胞术检测不同细胞周期阶段细胞比例(图S6)。如图3B所示，与对照组相比，模型组G0/G1期细胞周期阻滞更明显(对照组48.43±1.46%，模型组71.75±0.66%(P<0.01)，蛋白组57.41±0.55%(P<0.01))。
图2 Cd处理对骨髓间充质干细胞的影响。倒置显微镜观察各组骨髓间充质干细胞增殖情况(A、B、C)，诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞(D、E、F)后茜素红染色的细胞形态。透射电镜观察对照组(G组和J组)、模型组(H组和K组)和蛋白组(I组和L组)骨髓间充质干细胞超微结构的变化。N:细胞核，Mt:线粒体。
图3 Cd处理可诱导骨髓间充质干细胞凋亡和细胞周期阻滞。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。计算细胞凋亡率(A)和各细胞周期的细胞比例(B)。数据被描述为平均SD(n=3)。
3.蛋白质组学分析
我们为鉴定DEPs，取BMSCs胞浆组分的2-DE凝胶分析3组凝胶对应的3幅图像，如图3C-E所示，蛋白样品在清晰的考马斯蓝染色凝胶中分离，这些蛋白点主要分布在等电点(pI)4~7范围内。如前所述，我们进行2-DE凝胶图像处理，大于1.5倍的斑点间差异显著(P<0.05)，视为DEPs。如图3C-E，我们采用PDQuest软件分析1.5倍变化且P < 0.05的DEPs。根据分子功能、细胞成分和生物学过程对GO进行分类，以了解这些DEPs的生物学作用，其中前20个GO术语用图4A-C表示。从分子功能上看，这些DEPs主要与RNA结合(8个点)、相同的蛋白结合和ATP酶活性(6个点)、ATP结合(5个点)、肌动蛋白结合和蛋白结构域特异性结合(4个点)有关。高表达的细胞成分主要包括胞浆(15个斑点)、胞外外泌体(13个斑点)、细胞核、细胞质和膜(各11个斑点)、内质网和胞外间隙(各9个斑点)。对于生物学过程，这些DEPs在铁离子稳态、肌肉收缩、细胞骨架组织、蛋白质折叠以及内质网中的蛋白质折叠等方面明显富集(各4个点)。我们选择GRP78、HSC70、STIP1、HMOX1、FRIL1、VIM、CALR、ACTB、TCTP和PGK1等10个基因进行qPCR分析，以定量其转录水平(图4D和E)；其中，HSC70、STIP1、FRIL1、VIM、CALR、ACTB、TCTP和PGK1在转录本和蛋白水平的表达模式相似，而GRP78和HMOX1则相反。
图4 Cd处理的BMSCs差异表达蛋白的基因本体(GO)注释(II)。利用UniProt数据库(http://www.UniProt.org/)对来自BMSCs的19个DEPs进行了GO分类搜索，包括(A)分子功能，(B)细胞成分和(C)生物过程。qRT-PCR蛋白质组学分析的验证。与对照组相比，候选基因主要包括部分上调基因(D)和下调基因(E)。
4.代谢组学分析
NMR谱分析共鉴定了70种代谢物，这些代谢物主要属于不同类别的氨基酸(如丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸)、糖类(如葡萄糖)、渗透压物质(如甜菜碱)、TCA循环中的中间产物(如富马酸、苹果酸和琥珀酸)和能量相关代谢物(如葡萄糖、肌醇)。PCA作为一种无监督模式识别方法，可以作为一种统计策略来评价分析的重现性和稳定性。它不是分析每个数据的成分，而是在几个数据聚集在一起形成分布时，分析主成分分布的一种方式。本研究采用三组间70种代谢物进行PCA模型和载荷图评估样本间的潜在变异性。PCA在数据集中捕获了97.5%的变异性，PC1占68.1%的变异性，PC2占29.4%的变异性(图5A和B)。然而，然而，虽然在本研究中PCA评分显示三组之间有明显的分离，但可能不足以对每组三个样本的PCA图进行分析。因此，我们对所得到的代谢组学图谱进行了层次聚类分析，以进一步揭示主要与这些已鉴定的代谢产物存在的深层次差异(图5C)。在所鉴定的70种代谢物中，37种代谢物在三组中均有分布(图5D和表S3)。我们使用MetaboAnalyst数据库进行代谢途径富集分析，共鉴定到19条关键代谢途径(图6)。这些代谢途径主要参与氨基酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、嘧啶代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、丙酮酸代谢。
图5 来自不同组别BMSCs的70个鉴定代谢产物的PCA评分图(A)和负荷散点图(B)。椭圆代表95%的置信区间(n=3)。(C)三组间鉴定代谢产物的层次聚类(n=3)。(D)Venn图显示跨越对照、模型和蛋白质组的代谢物数量。
图6 使用MetaboAnalyst4.0对鉴定出的BMSCs代谢产物通路分析总结。这些圆的颜色从白色到黄色再到红色，对应于增量的折叠变化(-log(p))，而它们的大小与路径影响的程度有关。
讨论
铁蛋白是一种主要的铁储存蛋白，在生物免疫和重金属解毒中具有重要的意义。前期研究表明，可口革囊星虫铁蛋白对Cd(Ⅱ)等重金属离子具有一定的富集能力，Cd(Ⅱ)对几乎所有的生命形式都具有急性毒性，Cd毒性主要导致与骨骼相关的并发症，如骨痛病。此外，BMSCs具有向成骨细胞分化的能力，能够保证骨组织的健康，但Cd(Ⅱ)的存在可能会影响其分化过程，因此，我们从海洋无脊椎动物可口革囊星虫中重组表达了PeFer-CdⅡ铁蛋白，并探讨了PeFer-CdⅡ的功能特性。我们通过细胞实验研究PeFer对Cd(Ⅱ)诱导的BMSC损伤的保护作用，并结合蛋白质组学和代谢组学的综合分析探讨其分子机制。本研究采用ICP-MS法测定了PeFer-CdⅡ和HoSF-CdⅡ中的Cd含量，揭示了PeFer-CdⅡ与HoSF-CdⅡ相比Cd含量显著升高(图1B)。这一结果与Ding等人的前期研究一致。同时，氨基酸序列比对显示，PeFer与HoSF的同源性约为55%，表明这些差异氨基酸可能影响其结合Cd(Ⅱ)的能力，从而导致其对Cd的吸收富集能力存在差异。CD光谱结果表明，两种铁蛋白的二级结构在Cd富集后很可能保持稳定(图1C和D)，但PeFer-CdII和HoSF-CdII折叠略有变化，推测是由于Cd(Ⅱ)与铁蛋白氨基酸残基形成的配位键所致。同时，配位键的形成也可以用来解释基于AFM分析的两种铁蛋白在高度剖面上的差异。AFM图像高度剖面分析发现，PeFer-CdII与HoSF-CdII的高差在10nm或更小(图S3)，表明这些结构由单层组成，没有形成大的团聚体。此外，EDS光谱分析进一步证实了PeFer和HoSF对Cd(Ⅱ)的富集能力(图S2)。这些结果共同表明，PeFer和HoSF对Cd(Ⅱ)都表现出了特定的吸附能力，而PeFer可能更适合用于Cd的富集。鉴于PeFer对Cd的吸收和富集作用，我们采用铁蛋白防止BMSC受到Cd(Ⅱ)损伤可能是一种有前景的保护策略。因此，我们对Cd(Ⅱ)单独及Cd(Ⅱ)与PeFer联合处理对BMSCs细胞活力、凋亡及细胞周期进程的影响进行了相关的实验评价。我们观察到模型组和蛋白组的细胞形态发生了明显的变化(图2)，表明Cd(Ⅱ)的主要毒性作用很可能影响BMSCs向成骨细胞分化。此外，与对照组相比，模型组和蛋白组BMSCs的凋亡率显著增加，而与蛋白组相比，模型组BMSCs的凋亡率明显增加(图3A)。结果表明，Cd(Ⅱ)抑制BMSCs生长的机制不涉及诱导细胞分化，而PeFer的加入可以保护细胞抵抗Cd(Ⅱ)损伤，减轻细胞的Cd毒性。铁蛋白可能通过配位与Cd结合来防止对细胞的直接毒性作用，因为在这些细胞中Ca2+可以被Cd2+取代。同时细胞周期分析显示，与蛋白组相比，模型组细胞在G0/G1期明显增多，而在S期和G2/M期相对减少(图3B)。可以假设Cd(Ⅱ)通过诱导G0/G1细胞周期阻滞和凋亡抑制BMSC增殖，但PeFer的存在可能在保护BMSCs免受Cd(Ⅱ)诱导的DNA损伤方面发挥了至关重要的作用，这些结果共同暗示PeFer有助于减少Cd(Ⅱ)诱导的BMSCs凋亡，延缓G0/G1细胞周期进程。蛋白质组学和代谢组学方法已经被用来揭示样品之间蛋白质和代谢物的生物学变化。在本研究中，我们发现这些改变的蛋白主要参与一些酶促反应，其中大部分参与了几条重要的代谢通路，如图7所示，与对照组相比，蛋白组16个DEPs的变化趋势与模型组相似，其中模型组和蛋白组有4个DEPs上调，12个DEPs下调(表S2)。模型组和蛋白组均上调的蛋白包括MYH9、GRP78、HSC70和STIP1，其中HSC70和STIP1基因在转录水平上也上调(图4D)。MYH9的作用基于其在大多数细胞和组织中的表达而被广泛报道，MYH9参与各种生物过程，如胞质分裂和信号转导，MYH9也与疾病的严重程度以及肌动蛋白细胞骨架重组有很强的关系(图6)。伴侣蛋白HSC70的上调可能通过抑制凋亡信号通路，促进蛋白质折叠、凋亡调控和对应激的保护。值得注意的是，我们发现与模型组相比，蛋白组GRP78和STIP1表达上调(表S2)。GRP78是一种成熟的内质网（ER）分子伴侣，在蛋白质折叠，ER应激反应和细胞存活中起作用。STIP1作为一个支架适配器和应激反应蛋白，在细胞生存中发挥着关键作用，并在保护细胞免受应激的独特特性中表现出多种细胞内和细胞外的作用。另外，我们观察到，在模型组和蛋白组中，VIM、CALR、ACTB、TPM1、TPM4、TCTP、PEBP1、ENO1、PGK1、HMOX1和FRIL1下调。我们的结果还显示，Vim、Calr、Actb、Tctp和Pgk1基因在mRNA水平上的表达与其蛋白丰度表现出类似的趋势(表S2和图4E)。其中，VIM、CALR、PDIA3与ER关系密切，如图7所示。VIM在正常间充质细胞中广泛表达，具有维持细胞完整性和抵抗应激的功能。CALR是一种高度保守的ER伴侣Ca2+结合蛋白，在细胞中过表达，导致G0/G1细胞周期阻滞，抑制细胞生长速度。TCTP在许多细胞过程中起着重要作用，如蛋白质合成和细胞生长。此外，ENO1和PGK1蛋白除了具有先天的糖酵解功能外，还具有一些与病理生理过程相关的功能。有趣的是，我们还发现，与对照组相比，模型组PDIA3下调了0.73倍，而蛋白组PDIA3上调了2.35倍(表S2)。PDIA3是调节蛋白折叠和响应内质网应激的伴侣蛋白，其下调可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。基于这些结果，我们推测Cd(II)对骨髓间充质干细胞的损伤可能干扰内质网应激介导的细胞凋亡通路和能量代谢，从而抑制细胞生长速度，引发细胞凋亡。然而，PeFer的加入可能在Cd(II)诱导的骨髓间充质干细胞损伤中发挥关键作用，保护细胞免受细胞凋亡，促进细胞存活。在本研究中，我们使用qRT-PCR对BMSCs中不同处理组中鉴定的DEPs变化进行补充。尽管qRT-PCR分析是一种准确且常用的定量基因表达水平的技术，但利用2-DE分析鉴定出的这些蛋白斑点可以进一步采用Western blot分析获得更好的结果。因此，我们认识到qRT-PCR与Westernblot分析或ELISAs的结合可能是今后工作中验证部分蛋白质2D凝胶图像分析结果的较好选择。代谢组学是一种新开发的基因组学，转录组学和蛋白质组学之后的系统生物学方法，旨在为细胞和生物体液中的所有小分子代谢物提供全局快照。在目前的研究中，我们试图探讨单独使用Cd(II)的BMSCs和Cd(II)和PeFer联合处理的代谢物与使用基于1H-NMR的代谢组学的对照组相比的变化趋势。如表S3所示，我们在三组细胞1H-NMR光谱中共检测到70种代谢物。PCA分析结果显示，不同处理组的骨髓间质代谢产物沿PC1轴显著分离(图5A和B)，表明Cd(II)在代谢组学上具有毒性，对骨髓间质有较好的保护作用。代谢途径富集分析表明，这些差异代谢产物可能主要与能量代谢、氨基酸代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢有关(图6和图7)。目前，与能量代谢相关的代谢产物主要参与糖酵解途径和三羧酸循环。如图7所示，与对照组相比，模型组和蛋白组糖酵解相关代谢产物葡萄糖、肌醇等均显著减少。这些糖和糖醇可能已经被分解成一些有机酸(如丙酸和柠檬酸)，以提供额外的能量。而丙酮酸作为糖酵解的最终产物，仅在模型组细胞中显著增加，在三羧酸循环及尿素循环、脂类合成等通路中起主要作用。同时，丙酮酸水平升高可导致模型组乳酸和乙酸水平升高，而蛋白组乳酸和乙酸水平降低(图7)。乳酸是糖酵解的最终产物，乳酸积累通常预示较差的结果，如线粒体功能障碍，可以通过阻止丙酮酸进入三羧酸循环来满足缺氧组织的能量需求。同样，乙酸盐是一种关键的碳源代谢物，在几乎所有的生物中起着关键作用。在本研究中，与对照组相比，蛋白质组中的TCA循环中间体，例如苹果酸盐，富马酸盐和琥珀酸盐增加（图7）。值得注意的是，模型组富马酸水平的升高可能归因于酪氨酸作为TCA循环代谢物合成的前体。本研究结果暗示Cd(II)可能导致骨髓间充质干细胞线粒体损伤，而添加PeFer很可能通过增强能量代谢来改善这种情况。在目前的研究中，多种代谢途径(例如，丙氨酸和天冬氨酸代谢，甘氨酸，谷氨酸和谷氨酰胺代谢，嘌呤和嘧啶代谢)主要由于Cd（II）对BMSC的损伤而被破坏（图7）。其中，大多数必需氨基酸（例如色氨酸和苯丙氨酸）和非必需氨基酸（例如谷氨酸，精氨酸，天冬氨酸和甘氨酸）在模型或蛋白质组中表现出显着降低（表S3），这可能与尿素和TCA循环密切相关。色氨酸参与氧化应激和免疫应答的调节。作为脯氨酸和鸟氨酸的前体，谷氨酸提供碳源以支持细胞增殖，并充当氨基酸和碳水化合物代谢之间的中心界面。另外，由于其在核苷酸合成中的关键作用，天冬氨酸已被鉴定为细胞增殖的关键代谢物。值得注意的是，精氨酸仅在蛋白质组中检测到，它是影响细胞生长、增殖和免疫的不同代谢物合成的重要底物。Ran等也报道了甘氨酸可以抑制氧化应激并转化为丝氨酸和胆碱，并参与嘌呤和嘧啶的生物合成，如图7所示。此外，我们的研究发现，在模型组和蛋白质组中甜菜碱和牛磺酸水平显著降低，表明渗透调节、氧化应激的紊乱以及膜损伤。总的来说，这些结果表明骨髓间质干细胞可能受到与Cd(II)氧化应激和免疫应答相关的生物过程的严重破坏。进一步对凋亡的特定标记物、活性氧(ROS)测定和核形态检查进行全面的研究将有助于为结果提供更有说服力的证据。因此，我们小组将对这一现象的具体情况进行进一步的研究。
图7 相关代谢通路参与BMSCs某些已鉴定的代谢产物和差异表达蛋白。候选蛋白包括肌球蛋白9(MYH9)、78KDa葡萄糖调节蛋白(GRP78)、波形蛋白(VIM)、钙网蛋白(CALR)、肌动蛋白、细胞质(ACTB)、原肌球蛋白α-1链(TPM1)、原肌球蛋白α-4链(TPM4)、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)、热休克同源蛋白71Kda(HSC70)，应激诱导的磷蛋白1(STIP)，蛋白二硫键异构酶A3(PDIA3)，α-烯醇化酶1(ENO1)，磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，血红素加氧酶1(HMOX1)和铁蛋白轻链1(FTL1)。
结论
总体而言，本研究综合蛋白质组学和代谢组学方法，考察单独Cd(Ⅱ)处理和联合Cd(Ⅱ)和PeFer处理BMSCs的蛋白质和代谢轮廓的生物学变化，从而揭示Cd(Ⅱ)毒性的内在机制和PeFer对BMSCs的保护作用。结果表明，我们利用蛋白质组学方法共检测和分析了19种显著性DEPs，另外1H NMR代谢组学方法鉴定出70种代谢物。我们推测Cd(II)可能诱导线粒体损伤，破坏三羧酸循环、氨基酸代谢、嘌呤和嘧啶代谢等生物学过程，从而抑制细胞生长速度，引发细胞凋亡;然而，添加PeFer可能保护骨髓间充质干细胞对抗细胞凋亡，提高Cd(II)损伤的细胞存活率。然而，有必要对使用PeFer作为Cd(II)损伤保护层的更详细机制进行进一步研究。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33529923/----------微科盟更多推荐----------
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