科研 | Nat Commun.： 异羟肟酸修饰的肽芯片用于分析同工酶选择性相互作用和组蛋白脱乙酰酶的抑制

点击蓝字↑↑↑“微科享”，轻松关注不迷路

编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

组蛋白通过调节染色质的结构和功能来控制基因的表达。组蛋白侧链上的翻译后修饰（PTMs）形成了表观遗传景观，表观遗传景观受到表观遗传调节酶的严格控制，并进一步被所谓的蛋白结构域识别。组蛋白微阵列已被广泛应用于研究组蛋白-识别相应修饰位点的蛋白质相互作用，但对Zn²⁺依赖性组蛋白去乙酰化酶（HDAC）清除酶的瞬时相互作用的研究还不多见。在这里，我们合成了羟肟酸修饰的组蛋白肽，并将其用于直接捕获和检测四种I类HDAC同工酶的飞莫尔级微阵列。后续的溶液功能分析为发现HDAC底物以及抑制剂在细胞分析中具有纳摩尔效价和活性提供了依据。我们认为，类似的羟肟酸修饰的组蛋白肽微阵列和文库可以广泛应用于鉴定Ⅰ类HDAC同工酶特异性底物，并有助于开发同工酶选择性HDAC抑制剂和探针。

论文ID

原名：Hydroxamic acid-modified peptide microarrays for profiling isozyme-selective interactions and inhibition of histone deacetylases译名：异羟肟酸修饰的肽芯片用于分析同工酶选择性相互作用和组蛋白脱乙酰酶的抑制
期刊：Nature Communications
IF：12.121发表时间：2021.01通讯作者：Hans M. Maric、Christian A. Olsen
通讯作者单位：维尔茨堡大学、哥本哈根大学

实验设计

实验结果

1. 修饰后的多肽能以微阵列格式对HDAC结合进行探究
由于乙酰化多肽的快速转换和产生的短暂HDAC肽相互作用，传统的微阵列显示方式不允许研究HDAC的结合。我们设想，类似于常见的I类HDACs竞争性抑制剂的乙酰化多肽修饰能够以微阵列形式捕获和检测HDACs。此类抑制剂的帽基与靠近催化口袋的酶表面相互作用，并且连接体通过通道将锌结合基团投射到活性位点中的Zn²⁺离子（图2a）。因此，依赖于Zn²⁺的HDACs可以抑制Kac被锌结合基团所取代的Kac含肽的循环，而含有羟肟酸或邻氨基苯胺功能的肽已被证明可以结合和/或捕获HDAC酶。在这里，我们探索了在组蛋白尾肽微阵列中的这些片段来检测I类HDACs的结合。我们采用μSPOT法（SPOT方法的一种变体）制备了修饰肽芯片。我们发现用L-2-氨基-8-（羟胺基）-8-氧辛酸（Asuha）或L-2-氨基-8-（（2-氨基苯基）氨基）-8-氧辛酸（Asuapa）替换组蛋白序列中的赖氨酸残基，而不是L-2-氨基亚油酸（Asu）或乙酰化赖氨酸（Kac）有效捕获HDAC-底物相互作用（图2b）。Asuha和Asuapa都提供了序列依赖性结合结果，由于Asuha对应的肽段显示出较高的HDAC保留量，因此我们选择Asuha进行进一步的研究。另外μSPOT方法的合成效率在15-16-mer长度上明显降低，因此我们选择了15个残基。我们的研究结果与观察结果一致，I类选择性邻氨基苯胺类药物，如已批准的药物奇达明和临床试验候选药物恩替诺司他，是最有效的抑制剂之一，仅被选择性较低的含羟肟酸的化合物（如帕诺毕诺司他）所超越。接下来，我们设想羟肟酸修饰的肽微阵列可以直接、简单地与HDAC同工酶的结合，并可能促进同工酶选择性抑制剂和探针的开发（图1c）,该技术的实现要求对Ausha模块进行合成路线改进。与先前报道的合成方法相比，我们对乙酰氨基丙二酸二乙酯烷基化/酶解策略进行修饰，为Fmoc-Asuha（^tBu）-OH（2 g，20%总收率，补充图1）提供了一条经济实惠且可扩展的合成路线。然后制备羟肟酸修饰的μSPOT点阵列，并在打印微阵列之前通过对粗肽子集的LC-MS分析验证修饰肽的成功合成（补充表1）。粗肽在层析前无法研磨，因为产生的量很小，由此产生HPLC示踪法以保护基团副产物。然而，我们观察到平均纯度为41%，对应的平均偶联效率至少为95%，这符合标准的SPOT和μSPOT44肽合成。我们采用辣根过氧化物酶( HRP )标记的抗His抗体对μ-SPOT玻片上一系列带有His标签的HDAC2的稀释液进行检测，发现信号与斑点量呈线性关系。（补充图2，r2=0.96）。因此，μSPOT方法可以在单轮合成中经济实惠地生产数百个微阵列副本，从而促进了HDAC同工酶肽相互作用的半定量评估（图1c）。 图1 用于直接捕获和检测I类HDAC同工酶的羟肟酸修饰微阵列。a 11个Zn²⁺依赖性HDACs的系统发育关系。b X射线共晶体结构显示HDAC8的结合袋与含kac的肽底物或羟肟酸相互作用。与Kac(左，PDB: 5DIC, Y306F突变需要失活)相比，羟甲基酸(右，PDB: 3EW8)通过螯合活性位点中的Zn²⁺离子来阻止瞬时相互作用。c 工作流程。采用适当的含羟肟酸的氨基次氯酸类似物(Asuha)制备肽芯片。由此产生的阵列允许直接评估HDAC亚型特异性结合。Kme1、Kme2、Kme3: ε- n -单甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸和三甲基赖氨酸;pS: O-phosphoserine;pT: O-phosphothreonine;Kac:ε-N-acetyllysine。
 图2 锌结合基团允许以微阵列形式探究HDACs。a 针对I类HDACs的已批准药物和临床试验候选药物的例子。b 在微阵列载玻片上显示和探测用于捕获HDAC3（10 nM）的修饰的15-聚体组蛋白肽。将2-氨基次戊酸羟肟酸衍生物(Asuha)或2-氨基次戊酸邻氨基苯胺衍生物(Asuapa)与羧酸(Asu)结合，可以以微阵列形式检测HDAC结合(n = 2个独立实验)。源数据作为源数据文件提供。
 2. 基于微阵列筛选和精细定位I类HDAC相互作用
接下来，我们探索了羟肟酸修饰的微阵列用于研究I类HDAC底物识别。为了全面系统地研究HDACs13和8对四个核心组蛋白的识别作用，我们在赖氨酸残基的位置展示了一个包含291个组蛋白的肽库（16个氨基酸长度和3个残基移码）。微阵列拷贝用重组人His标记的Ⅰ类HDACs滴定，并像以前一样用抗His抗体检测结合。已知结合位点的重现证明了我们平台的可靠性。正如预期的那样，只有包含Asuha残基的肽能够富集HDACs。与此同时，我们观察到同工酶的亲和性和选择性存在显著差异（图3）。HDACs1、2、8表现出较高的序列特异性，这与之前对HDAC8的底物选择性研究一致，与HDAC6相似。相比之下，HDAC3结合更加混杂，并且与位于组蛋白核心和尾部的序列结合。这可能表明HDAC3对肽序列不太敏感，短肽底物和乙酰化肽微阵列也有报道；生成序列标志图以突出每个HDAC的氨基酸偏好（补充图3）。这些图显示，所有I类HDACs都总体倾向于Ausha残基两侧的Arg和Lys残基，HDAC8和HDAC3在一定程度上都有这种倾向性。有趣的是，HDAC6显示了相反的倾向性。我们进一步观察到I类HDAC对包含Gly在-2和-3位置，Arg和Lys在4、+3和+4位置的序列的选择性。毫无疑问，组蛋白尾部富含精氨酸、赖氨酸和甘氨酸残基，这可以解释为序列偏好性。在这方面，我们期望将来对潜在同工酶偏好的评估将受益于随机肽阵列的使用。微阵列也被应用于结合位点的定位和结合亲和力的半定量估计。对组蛋白H4赖氨酸12（H4K12）进行了概述（图4a）。单氨基酸框架位移肽和单氨基酸截短变体的滴定表明了确切的结合位点，并表明所选肽的C末端是结合HDACs 1、2和8所必需的（补充图4-7)。然后合成、纯化肽1a5a，并将其作为HDAC抑制剂进行试验，以验证这些观察结果。肽4a和5a显示出比亲本肽（1a）低10倍的效力，如关于HDACs 2和8的数据所示（图4c和补充图8）。更引人注目的是，C末端截断的肽2a和3a对所有的HDAC都保留了效力。这可能表明HDACs 1、2和8对微阵列基质的空间效应特别敏感，很难与C端肽缀合位点附近小于5个氨基酸的Asuha残基结合。另一方面，HDAC3不受此影响，这也可以解释此同工酶阳性率较高的原因。总的来说，H4K12位点的定位揭示了HDACS1、2和8的复杂序列要求，尤其是相对于乙酰化赖氨酸的7个位置内的残基。以上结果强调了固定化引入的空间效应重要性，对我们验证溶液中重新合成肽的结果具有重要意义。 图3 微阵列格式筛选I类HDAC组蛋白肽结合。HDAC与含Asuha (X)组蛋白肽的相对亲和力的热图表示。pEC₅₀的值代表HDAC酶的浓度需要半最大结合信号(n=4个独立的剂量反应实验)。白色方块代表弱粘合剂(pEC₅₀ <7.6)。N.D.=未确定(非s形数据)。源数据作为源数据文件提供。*HDAC3与NCoR2的去乙酰化酶激活域(DAD)联合检测。基质空间效应可能阻碍蛋白质与这些肽的结合。
 图4 羟肟酸修饰肽芯片在肽结合需求定位中的应用。a 在微阵列格式中，HDAC1的相对结合亲和力的精细映射。b 重新合成的肽序列包括亲本肽（1a）、两个帧移序列（2a，4a）、一个C截短序列（3a）和一个N截短序列（5a）。c 再合成肽1a-5a的抑制曲线与其对应的针对HDAC1的微阵列结合曲线的比较。(芯片数据代表平均SEM, n = 4个独立实验;抑制数据代表n = 2个独立实验)。关于HDACs 2、3和8的数据以及最大抑制浓度的数据见补充图8。源数据作为源数据文件提供。
 3. 基于微阵列翻译后修饰的结合效应研究
包括HDACs在内的表观遗传调节剂的作用是由PTMs协调的。接下来，我们应用我们的微阵列方法来解决特定的PTM组合如何控制同工酶特异的I类HDAC功能。为了探索这一点，我们根据报道的组蛋白PTMs（补充表4），选择了两个H3N末端肽进行组合修饰。所包括的修饰物包括磷酸核糖（pS）、O-磷酸苏氨酸（pT）、ε-N-甲基赖氨酸、ε-N-二甲基赖氨酸和ε-N-三甲基赖氨酸（分别为Kme1、Kme2和Kme3）、Kac和ε-N-硫代乙酰赖氨酸（Kthioac），这是一种Kac类似物，对水解酶的稳定性增强，只有HDACs 6、HDACs 8和I类乙酰化酶能在一定程度上裂解水解酶。值得注意的是，微阵列方法解决了复杂和高度同工酶特异性的结合谱（图5a）。重要的是，残基Ser10或Thr11的磷酸化减少了HDAC与H3肽的结合。相反，通过修饰Lys4和Thr6残基，HDACs1、2和8的富集得到改善。Lys23的修饰也减少了HDAC8的结合，尽管其接近C末端，由于上述的基质空间效应，很难解释这种趋势。值得注意的是，微阵列中H3S10磷酸化的显著效果可能反映了表观遗传酶的识别改变，而表观遗传酶在组蛋白修饰的交叉对话中发挥着关键作用。为了进一步验证HDAC同工酶对底物识别和选择性的预测，我们研究了重新合成的Lys4和Ser10位点修饰肽的去乙酰化。因此，H3序列通过标准Fmoc/^tBuSPPS分别进行或不进行硫代乙酰化和磷酸化的Kac修饰肽段(图5b)，并与重组I类HDAC一起培养；底物转化后进行LC-MS分析，结果显示，如微阵列芯片所预测，Ser10磷酸化降低了HDACs的去乙酰化，而Lys4硫代乙酰化没有促进HDACs 1、2和8的转化（图5b和补充图9）。综上所述，我们的结果强调了羟肟酸修饰的微阵列的适用性，它可以用来检测HDAC底物的变化，这些变化会导致高通量下的实质性识别改变。我们证明了这些微阵列可能有助于识别个别位置和特异性PTM，这些PTM严重改变肽结合亲和力和同工酶选择性；因此，为研究HDAC功能及其调控提供了有用的工具。 

图5 组蛋白PMSs对HDAC作用的调控。a 邻近化学修饰对H3（1-16）K9Asuha和H3（10-25）K18Asuha亲和力影响的热图。p：磷酸化，ac：乙酰化，thioac：硫代乙酰化，me1：单甲基化，me2：去甲基化，me3：三甲基化。4、5和6个修饰的组合取消了与H3（1-16）K9Asuha肽的结合，因此未包括在内。pEC50值代表半数最大结合信号所需的HDAC酶浓度，n=4个独立实验）。白色方块代表弱粘合剂（pEC₅₀<7.2）。源数据作为源数据文件提供。b 以Kac为研究位点重新合成肽序列，并通过I类HDACs相对去乙酰化。将酶和底物在37℃温育1小时，并通过LCMS测定相对转化率（样品测定痕迹参见补充图9）。微阵列数据代表平均SEM，n=4个独立实验；转换数据代表平均SD，n>2个独立实验。*HDAC3与NCoR2的DAD域结合使用进行了测试。基质空间效应可能有助于这些位置的效应。

 4. 具有特异同工酶选择性的HDAC抑制剂的鉴定
已有多种天然和合成的Ⅰ类HDACs抑制剂（HDACs1-3和HDACs1-8）被报道，其中一些已被批准用于临床。大多数是带有羟肟酸部分的小分子，表现出有限的同工酶选择性。微阵列筛选（图3和5）鉴定了具有潜在同工酶选择性的修饰肽，表明即使很小的化学修饰也能对HDAC识别产生强烈的同工酶选择性作用。为了验证所报道的选择性并量化它们对I类HDAC的抑制效力，我们从初始筛选中重新合成了另外9种含羟肟酸的肽（9a-17a），并在体外荧光分析中评估了HDAC抑制作用。在肽6a、13a和14a的情况下，所有测试的肽对HDAC1 3和HDAC8显示出强大的纳摩尔效力（图6a和补充图10）。正如预期的那样，含有赖氨酸残基而不是Asuha的对照肽即使在高微摩尔浓度下也不能抑制任何被测的HDAC。确定的抑制剂谱证实了多重命中的效力，验证了肽支架可以实现同工酶选择性的概念，但也揭示了在微阵列筛选过程中可能忽略了有效的抑制剂。序列11a、12a和13a在微阵列中表现出对HDAC3的选择性（图3）。对于重新合成的肽，我们发现HDAC3、HDAC1和HDAC2的选择性分别为~4倍、~2倍和>8倍（图6c，d），这支持使用我们的筛选技术来发现选择性铅抑制剂。肽11a对HDAC3和HDAC8的选择性也大于60倍，而肽13a对HDAC8的抑制作用是潜在的，这是没有预料到的。有趣的是，与HDAC8相比，肽9a和16a对HDAC13显示出超过100倍的选择性（图6c，d），这在含羟肟酸的抑制剂中并不常见。相反，肽14a以相似的效力抑制所有四种同工酶，与微阵列数据一致（图3和6d）。细胞溶质同工酶HDAC6也包括在分析中，因为它被几种已知的含羟肟酸的HDAC探针所抑制。肽1a和15a分别是针对该同工酶的最强和最弱抑制剂（1a-:Ki=5.31±0.03 nM，15a:-Ki=114±2 nM，补充图11a）。正如预期的那样，抑制剂对IIa类HDACs具有高度选择性，以HDAC4为代表，仅在抑制剂浓度高达50 μM时部分被抑制（补充图11b）。虽然微阵列的发现重现了再合成肽的一些效力记录，但在微阵列筛选中，一些较弱的结合剂的效力没有被准确估计，因此在应用该技术时需要详细的后续验证（补充图12）。在阵列实验中，肽13a和17a表现出对HDACs2和3的偏好，而不是HDAC1，当在溶液中测试时，它们在所有三个重组HDACs1-3中都是等势的。这再次强调了在微阵列格式中足够的C-末端间距的重要性，因为这两个肽包含了Ashua残基在5个氨基酸位点上。此外，肽11a是HDACs1和HDACs2最有效的抑制剂之一，在这两种同工酶的阵列上没有显示紧密结合。然而，微阵列筛选能够发现具有不同HDAC抑制谱的强效肽支架。此外，我们的数据证实了肽序列对底物转换、抑制剂效价和同工酶选择性的主要贡献（图6d和补充图13），表明肽支架是同工酶选择性抑制剂和亲和探针的合适来源。图6 鉴定具有不同选择性的HDAC抑制剂。a 含Asuha (X)肽(9a-13a)、含HDAC抑制剂SAHA和赖氨酸对照(9b 13b)的剂量响应HDAC抑制曲线。b 重新合成肽的序列。c 肽11a, 13a, 14a和16a的剂量响应曲线。d 微阵列筛选数据总结和溶液中重新合成的含Asuha肽的测定效力。视觉表示见补充图12。*HDAC3与NCoR2的DAD域结合测试。所有微阵列数据代表平均SEM, n = 4个独立实验;所有抑制数据代表n = 2个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
 5. 羟肟酸修饰肽在细胞中表现出活性
接下来，我们的目的是探索选定的HDAC抑制剂的细胞活性。我们选择了肽1a和13a，它们对Ⅰ类HDACs和HDAC6表现出纳摩尔效力，同时含有多种能促进细胞渗透的碱性残基。HEK293T细胞用肽处理5小时，随后的细胞裂解和Western blot分析显示，与DMSO对照组相比，微管蛋白和组蛋白的乙酰化上调（图7a）。这些结果强烈表明，肽1a和13a能有效地抑制细胞内的胞浆HDAC6和核HDACs1-3，这与它们对重组HDACs的体外抑制谱一致。特别是，肽13a诱导微管蛋白乙酰化增加8倍，H3K36乙酰化增加4倍（图7b）。因此，高通量筛选和随后的评估在解决方案交付细胞活性HDAC探针。图7 培养细胞中HDACs的抑制作用。a 以SAHA为阳性对照，用10 μM浓度的肽1a和13a处理5小时，Western blot检测微管蛋白乙酰化（Ac-α-微管蛋白）和组蛋白乙酰化（H3K27, H3K36）。b 乙酰化定量，用vinculin进行归一化，并相对DMSO。(数据代表平均SD, n = 4个生物独立样本)。源数据作为源数据文件提供。

讨论

肽微阵列被广泛应用于研究组蛋白修饰，特别是组蛋白的writers和readers。然而，他们对组蛋白乙酰化的应用仍然局限于基于活性的方法，因为微阵列结合实验需要二级读数。此外，基于活性的方法依赖于特定肽修饰的抗体，这有时会导致由序列上下文引起的偏差。在这里，我们描述了一种简单、经济、可扩展的方案来制备必要的羟肟酸构建块，并展示了其用于生产羟肟酸修饰的肽微阵列。这些阵列允许简单和直接的HDAC结合和抑制，最小的样本消耗和使用广泛验证的标签特异性抗体。当系统地使用时，类似的阵列可以提供大的数据集，并回答与HDAC行为及其调控相关的基本问题。在这里，我们演示了使用这种格式来识别确定同工酶特异性结合的单个位置和修饰，并发现具有定制HDAC选择性的细胞活性肽。羟肟酸修饰的多肽已被用作底物模拟物，并显示了HDAC底物识别的重要方面。在这里，我们系统地探索了组蛋白识别的序列和PTM需求，以Asuha修饰的多肽为代表，HDACs1、2、3和8。我们广泛的数据集将有助于进一步深入研究PTM对HDAC活性的具体影响。这些后续研究将受益于合成组蛋白和重组核小体的使用，它们可以揭示超出合成肽长度限制的序列效应。所选的抑制剂表现出纳摩尔效价和明显的选择性。然而，与底物结合的层次并不代表确切的抑制剂选择性概况。Asuha残基接近C末端的肽的效价预测不好，可能是由于微阵列基质的空间位阻干扰，微阵列筛选忽略了一些额外的强效抑制剂。从肽大环化合物的动力学研究和HDAC1与含氢氧基酯的H4基肽的X射线共晶结构，提示含肽的Asuha结合在活性位点。尽管如此，未来的研究应该探索HDAC底物周转与抑制剂的效价或选择性之间的相关性。这个问题可以使用本文提出的方法以及其他修改来解决，比如这里描述的Asuapa构建块。这些研究应考虑同工酶特异性效应、动力学参数和来自其他结合伴侣的贡献。此外，与携带活性位点突变的重组HDAC孵育或与已验证的HDAC探针共孵育可以改善阵列筛选中竞争性抑制剂候选物的选择。选定的微阵列点击被证明穿透细胞膜并诱导Ⅰ类和Ⅱb类HDAC靶点的高乙酰化。因此，结合断链和/或N-甲基化等结构优化，可以提供有前途的肽基HDAC探针。这里介绍的方法也可以应用于研究II a类HDAC，利用含有三氟甲基酮的结构单元和来自其他物种的脱乙酰酶。这里报道的HDAC探针可能是研究Ⅰ类HDACs的一类新型多功能工具的第一种，更重要的是也是它们的天然蛋白复合物。此外，所采用的原理可应用于其他肽基因芯片类型，包括高密度光刻和基于激光的芯片合成方法，从而进一步提高通量。另外，选择性结合检测方法可以提高筛选试验的动态范围，并潜在增强阵列的预测值。用细胞裂解液探索此类微阵列，使用标记的HDACs和复合物伙伴或高度特异性的抗体，可能为天然复合物的底物结合要求提供直接读出。将这样的读出与不同的细胞和组织结合，以及与扰动的HDAC水平结合，可以大大提高我们目前对HDAC在体内作用的认识。最后，我们设想目前的方法可以促进选择性化学蛋白质组学探针的发展，以补充已经应用的非特异性HDAC靶向探针。我们希望这项工作能够发现、表征和选择性靶向细胞活性，并有可能通过不同的HDAC亚型形成治疗相关的多蛋白复合物。

结论

在这里，我们报道了肽微阵列的合成和应用，通过引入含羟肟酸的残基来代替Kac残基来绕过上述限制，从而提供了一个高通量研究HDAC结合偏好的平台，功能分析评估了这种方法预测HDAC结合、抑制和活性的能力。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33397936/

----------微科盟更多推荐---------- 

免费生信作图平台——生科云
	长按左侧二维码  进入生科云
生科云所有分析工具可以免费使用，不收取任何直接或间接费用；您还可以在微信上联系微生态老师，随时获取免费的指导，帮助您解决分析时遇到的问题；专业的生信分析团队，持续添加、更新、优化生信云上的分析工具，集成多种生信分析流程，一键批量生成主流科研图，帮您节省时间，有更多的时间探究生物学意义。

----------微科盟精彩文章---------- 

如果需要原文pdf，请扫描以下二维码，加助理获取

微科享期待与您交流更多蛋白组学问题

（联系蛋白组学老师即可申请入群）

请关注下列二维码

了解更多蛋白组学知识