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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读乳腺癌(BC)是一个重大的公共健康问题，一旦发生转移，其预后非常差。肿瘤微环境和化学污染最近被认为独立地促进了转移细胞的发展。BC微环境部分由脂肪细胞和前脂肪细胞组成，其中可存储持久性有机污染物(POPs)。我们的目的是检验这两个因素(2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英(TCDD)和微环境)可能相互作用增加肿瘤侵袭性的假说。我们发现共暴露于TCDD和前脂肪细胞可以改变BC细胞的特性；此外，我们在体内证实，它诱导了癌症干细胞标记物aldh1a3的表达，以及诱导具有细胞内结构(CICs)的巨型癌细胞的出现，这与恶性转移进展有关。我们使用前脂肪细胞、POP和体内转移斑马鱼模型共培养的BC细胞系的研究结果表明，BC细胞及其微环境之间的相互作用可能影响其侵袭或转移潜能。论文ID
原名：Aggressiveness and Metastatic Potential of Breast Cancer Cells Co-Cultured with Preadipocytes and Exposed to an Environmental Pollutant Dioxin: An in Vitro and in Vivo Zebrafish Study译名：乳腺癌细胞与前脂肪细胞共培养并暴露于环境污染物二噁英：对斑马鱼体内和体外的研究
期刊：Environmental Health Perspectives
IF：8.382发表时间：2021.03通讯作者：Xavier Coumoul，Meriem Koual
通讯作者单位：法国巴黎大学
实验设计
实验结果
1. 使用xCELLigence®系统在对照、TCDD、共培养或共暴露条件下的MCF-7粘附性能
我们设计了一个易于实现的共培养模型（脂肪细胞和人类肿瘤细胞）。它被用来制造条件培养基和研究两种细胞之间的通讯。图1A用示意图描述了该模型，该模型用于研究TCDD对MCF-7肿瘤细胞表型的影响。简单地说，将MCF-7或MDA-MB-231细胞接种在6孔培养皿的底部，将hMADS前脂肪细胞接种在聚酯膜上。两种细胞都在同一种培养基中培养，这种培养基可以通过插入物扩散。24小时后，用25 nM TCDD或载体处理细胞48小时。在hMADS细胞存在下生长的肿瘤细胞称为共培养（无污染）；在经TCDD处理的hMADS细胞存在下生长的MCF-7或MDA-MB-231称为共暴露（因此，共培养+TCCD）。此外，我们收集了来自单独培养的MCF-7细胞（对照）、暴露于TCDD（TCDD）的MCF-7细胞、与hMADS细胞共培养的MCF-7细胞（共培养）和暴露于TCDD（共暴露）的共培养的MCF-7细胞的条件培养基（并用于随后的球体形成和斑马鱼幼虫转移试验；见下文）。我们首先使用xCELLigence®系统在控制、TCDD、共培养或共暴露条件下监测MCF-7粘附性能，该系统测量阻抗值并转换为CI（图1B和1C）。我们发现单独用TCDD处理的细胞没有明显高于对照组的CI。MCF-7细胞与hMADS细胞共培养（共培养）的CI值较低。与共培养条件相似，共暴露条件下的细胞也表现出较低的CI。为了确定每种培养条件下最相关的生物标志物，我们使用了非靶向方法（蛋白质组学是指代表细胞活性功能实体的蛋白质）。
图1 共培养模型及MCF7细胞的实时分析。（A）介绍2D共培养系统和方案。（B）xCELLigenceMCF-7细胞的动态监测，xCELLigence系统的代表图：细胞指数（CI）曲线是每个条件的平均值±标准差（重复）：对照组（*，载体MCF-7细胞，单独），TCDD（$，用25 nM TCDD处理的MCF-7细胞），共培养（€，与hMADS共培养的MCF-7）和共暴露（&，与TCDD共培养）。（C）通过分析间隔（26–48小时）内的线斜率，确定每种条件下CI的演变。每个图表表示六次测量的平均斜率（粗体）与对照±SEM相比。数值信息平均值±SEM和p值见表S1。（Kruskal–Wallis的H检验（k独立序列的非参数比较），然后是单因素方差分析检验（k独立序列的参数比较）。
2. MCF-7细胞在对照、TCDD、共培养或共暴露条件下的蛋白质组学分析、ALDH活性和肿瘤球形成
考虑到上述结果，我们对在不同条件下生长的细胞提取物进行了高通量蛋白质组学分析。我们量化了2238种蛋白质（表S1）。除了ALDH1A3[乙醛脱氢酶1A3，一种癌症干细胞（CSC）标记物]、CYP1A1和CYP1B1外，不同条件与对照条件相比差异非常小，而加入TCDD可以诱导CYP1A1和CYP1B1的表达。共培养条件没有显著影响，然而，高水平的ALDH1A3蛋白仅在共暴露条件下发现（图2A，第三组）。然后，我们通过FACS分析测量MCF-7细胞中的ALDH活性（它不仅代表ALDH1A3），发现与对照组相比，TCDD存在和共暴露条件下的ALDH活性显著更高（图2B）。总的来说，这些结果表明，ALDH1A3的蛋白水平在共暴露条件下更高，表明这两种因素（TCDD、hMADS）对MCF-7获得CSC特性的潜在影响。
图2 MCF7细胞的蛋白质组学分析和ALDH酶分析与hMADS共培养并暴露于25 nM TCDD中48小时。（A）MCF7细胞的高通量蛋白质组学分析MCF7细胞的蛋白质组学分析[对照组 (仅MCF-7细胞)，TCDD组 (25 nM TCDD处理MCF7 细胞)，共培养组(hMADS共培养MCF-7细胞)，共暴露组(TCDD共培养)]。图中显示了每个样品的生物四倍和技术三倍的平均值。当CYP1A1、CYP1B1和ALDH1A3出现在表现的右上部分时，它们被诱导。（B）ALDH（乙醛脱氢酶）酶活性检测MCF7细胞使用ALDEFLUOR分析（FACS分析）。DEAB用于抑制ALDH与ALDEFLUOR试剂的反应，提供阴性对照。根据DEAB对照细胞的门数设定ALDH阳性细胞百分比。图表表示ALDH阳性细胞百分比的平均值（粗体）与六次测量的对照±SEM相比。表S2中提供了数值信息平均值±SEM和p值。（Kruskal–Wallis的H检验（k独立序列的非参数比较），然后是单因素方差分析检验（k独立序列的参数比较，**p<0.01；*p<0.05）。
然后我们研究了MCF-7细胞形成肿瘤球的能力。我们发现细胞暴露在共同培养和共同暴露的培养基中形成了面积较大的球体（图3A和B）。因此，有必要对每种情况下发生的形态学差异进行更广泛的分析，重点是细胞骨架和粘着斑，这表明了侵袭性。
图3 球体形成试验。（A）连续两代在第7天拍摄的球体形成的代表性图像。只有乳腺干/祖细胞才能自我更新并生长成球形结构。对照组（载体MCF-7细胞，单独）、TCDD（用25nM TCDD处理的MCF-7细胞）、共培养（MCF-7与hMADS共培养）和共暴露（与TCDD共培养）。比例尺10 μm。（B）通道1中的球体面积（单位：μm2），使用各种条件下的介质。图表表示n（见图）测量值的平均值±SEM。数值信息平均值±SEM和p值见表S3。未经处理的MCF-7细胞单独代表对照条件（Kruskal–Wallis的H检验（k独立序列的非参数比较），然后是单因素方差分析检验（k独立序列的参数比较，****p<0.0001）。
3. 在对照、TCDD、共培养或共暴露条件下MCF-7和MDA-MB-231细胞中与细胞间结构相关的特性的评估
然后，我们在我们的细胞共培养模型中对MCF-7和MDA-MB-231细胞进行免疫荧光染色。分别用paxilin抗体和肌动蛋白抗体检测细胞骨架和局部粘附位点。在TCDD存在下，细胞分裂。与对照条件相比，paxilin的定位与焦点粘连和应力纤维的形成有点不同（图4A）。E钙粘蛋白mRNA表达较低（图S1）。共培养和共暴露条件下，细胞形态也发生了明显变化。当与hMADS共同培养时，MCF-7细胞遍布并有伸展的伪足（图4A）。此外，共暴露条件（hMADS+TCDD）诱导形成具有多核化特征的巨型细胞（具有多核的非常大细胞）（图4B）。多核巨细胞由多个不规则核定义，其细胞大小至少是正常二倍体癌细胞的2-5倍。所有这些特征都是用MCF-7细胞（图4A）观察到的，而且在相同条件下培养的另一种人BC细胞系MDA-MB-231也能观察到（图4C）。
图4 TCDD、共培养和共暴露后MCF7细胞和MDA-MB-231细胞的形态学差异。细胞用hMADS生长和/或用25 nM TCDD处理[对照（载体MCF-7细胞，单独），TCDD（用25 nM TCDD处理的MCF-7细胞），共培养（MCF-7与hMADS共培养）和共暴露（与TCDD共培养）]。处理48小时后，固定细胞，并对其进行paxillin、actin和细胞核（蓝色）染色。（A）MCF7细胞染色。（B）每个场（n=3）每个条件下MCF7细胞数量和巨细胞（具有多个细胞核的超大细胞）的定量。图表表示三个实验的平均值±SEM。表S4中提供了数值信息平均值±SEM和p值。Kruskal–Wallis的H检验（k独立序列的非参数比较），然后是单因素方差分析检验（*p<0.05）。（C）MDA-MB-231染色。用符号指出局灶性粘连（箭头）、片状足（*）和巨细胞（#）。
研究细胞的形成即研究细胞死亡、衰老、增殖或自噬等细胞过程，4种不同培养条件之间我们发现无任何差异（图S2）。因此，我们探索了这些共暴露于hMADS细胞和TCDD（共暴露条件）48小时的多核细胞的详细形态，例如评估β-连环蛋白的定位（图5A，第四组）。在共暴露条件下，β-连环蛋白被发现包围在其他细胞内的细胞，这些细胞有时是多倍体的（图5B）。相比之下，在TCDD条件或共培养条件下未观察到这种情况；这些特征是“细胞中的细胞”结构的特征（CICs，见讨论），通常与恶性转移进展相关。然后，我们使用一个经过验证的体内斑马鱼异种移植模型来研究我们细胞的转移潜能。
图5 MCF7细胞和MDA-MB-231细胞蛋白（A-actin，B-beta-catenin）定位及细胞核染色。MCF7细胞与hMADS一起生长和/或用25 nM TCDD处理48小时[对照组（载体MCF-7细胞，单独），TCDD（用25 nM TCDD处理的MCF-7细胞），共培养（MCF-7与hMADS共培养）和共暴露（与TCDD共培养）]。（A） MCF7细胞肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）染色。比例尺20μm。（B）MCF7细胞染色为β-连环蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。一个具有细胞内细胞结构的代表性细胞用星号（*）标记。比例尺20μm。注：TCDD，2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英。
4. 对照、TCDD、共培养或共暴露条件下MCF-7细胞在斑马鱼体内模型中转移扩散的评价
接下来我们研究了MCF-7和MDA-MB-231细胞体内转移的能力。我们使用了一个具有良好特征的斑马鱼异种移植人体癌细胞转移模型。由于斑马鱼幼体在光学上是透明的，实施荧光癌细胞(用于异种移植)和后续生长或内/外渗(早期转移)是容易的，该模型现在被认为是研究此类事件的有力工具。我们使用不同的条件培养基分别处理标记有CM-Dil和RFP-MDA-MB-231细胞的MCF-7细胞48小时，然后注射到2天龄斑马鱼幼虫的卵黄周间隙（图6），24小时后对鱼进行成像，计算每种培养基在尾部（血管丛）或头部（“头”）发生转移的鱼的数量以及每条鱼的转移数量。我们在对照组（n=32）、TCDD组（n=21）、共培养组（n=36）和共暴露组（n=34）中观察到53%的鱼类使用MCF-7细胞形成转移。与对照组相比，共暴露条件下每条鱼的转移数量显著增加（p=0.001）。头部转移仅在共培养和共暴露条件下观察到，分别有8%和21%的鱼受到影响；MDA-MB-231细胞也有类似的结果。我们使用对照培养基的鱼50% (n=46)，使用TCDD培养基的鱼51%(n=41)，使用共培养培养基的鱼58% (n=24)，使用共暴露培养基的鱼79%(n=42)观察到转移形成。与共暴露组相比，每条鱼的转移量显著增加（p=0.006），且仅在共暴露组观察到头极转移（40%的鱼有“头”转移）。
图6 斑马鱼幼虫体内模型中MCF7和MDA-MB231细胞转移扩散的测定人RFP-MCF7（左）或RFP-MDA-MB-231（右）细胞与来自不同条件的条件培养基一起培养，注射到2日龄斑马鱼幼虫的卵黄周间隙[对照组（单独使用载体MCF-7细胞）]，TCDD（用25纳米TCDD处理的MCF-7细胞）、共培养（MCF-7与hMADS共培养）和共暴露（与TCDD共培养）]。24h后用荧光显微镜对鱼进行8.5倍放大成像。（A）21-46条鱼/组的代表性图像。（B）定量（a）有一个或多个转移的鱼数量和（b）转移/鱼+SE的平均数量。图表表示三次测量的平均值±SEM。数值信息平均值±SEM和p值见表S8。（Kruskal–Wallis的H检验（k独立序列的非参数比较），然后是单因素方差分析检验（k独立序列的参数比较，*p<0.05）。（C）头部转移的鱼百分比。
讨论
在本研究中，我们使用MCF-7细胞或MDA-MB231细胞与hMADS前脂肪细胞共培养模型和TCDD对BC细胞的作用。我们发现，每种情况对MCF-7（粘附、迁移或增殖）的细胞特性都有不同的影响。我们还发现，人BC细胞在体外和体内都获得了前脂肪细胞培养和接触TCDD（一种持久性有机污染物）的前转移特性，我们称之为“共暴露”状态。利用斑马鱼幼虫，我们发现，在共同暴露条件下，利用特定培养基，两种人乳腺细胞系（MDA-MB-231和MCF-7细胞系）的脑转移率都明显增加。我们发现，这种共暴露在体外诱导巨细胞的出现，并获得了细胞的多倍体和细胞内的细胞结构（CICs）。我们还观察到，不规则核的产生，被鉴定为细胞核比常规二倍体癌细胞大2-5倍的细胞。CICs在各种癌症类型中均有报道，且大多与患者不良预后有关。我们使用β-连环蛋白染色来表征被吞噬细胞的冠状化，这一过程与合并或吞噬有关。Entosis最早于2007年被描述为一种非凋亡性细胞死亡程序，其特征是一个细胞侵入另一个细胞，入侵细胞在被降解或释放之前是短暂地存活的。相反，细胞自相残杀是一个细胞吞噬另一个活细胞的能力。细胞自相残杀被描述为一个过程，使得侵袭性肿瘤细胞能够不断被细胞邻居喂养。CICs通常与恶性转移进展相关，其存在已在人体样本中得到证实。核形态参数有助于识别侵袭性，并为生存率和肿瘤进展风险提供重要的预后数据。β-连环蛋白主要是这些巨细胞中的细胞质，其定位也是结直肠癌和乳腺癌转移的有用预测因子。进一步的研究将是必要的，以描述导致CICs产生的分子过程，并确定我们所观察到的确切情况，即昆虫或细胞自相残杀。这些细胞也获得了癌症干细胞的特性。肿瘤干细胞的标志物包括乙醛脱氢酶1A3（ALDH1A3）、CD44和CD133。具有这些标记物的细胞对化疗也更具抵抗力。CSCs是首次在人急性髓系白血病的血液单核细胞中被鉴定出来的。它们具有促进肿瘤转移的特性。在目前的研究中，我们发现共暴露条件下的细胞具有更高水平的ALDH1A3。在BC中，CSCs的ALDH活性已被证明是由ALDH1A3亚型引起的，ALDH1A3亚型是细胞转移倾向增加的标志物，尤其是在BC中。ALDH1A3表达可作为预后因素。ALDH1A3不仅是一种癌细胞生物标记物，而且也是CSCs发生的一个原因。乳腺癌细胞系中ALDH1A3的下调并不影响细胞增殖，但特别影响细胞迁移和细胞形成转移的潜能，它也被怀疑影响细胞存活。然而，维甲酸（ALDH1A3酶代谢物）在所有这些过程中的作用仍不清楚。我们的工作支持这样的假设，即前脂肪细胞和TCDD的共同作用导致了一个新的肿瘤细胞群体的出现，其性质类似于CSCs。我们专注于研究hMADS细胞的功能：我们实验室先前的工作表明，该细胞系是评估污染物毒性的人体模型。此外，它对于研究炎症途径的调节尤其有用，例如对二噁英的反应的研究。目前利用共培养模型对毒理学在致瘤过程中的作用进行的体外研究很少。这些模型的缺点是需要对功能实验上游的一种常见培养基进行表征，以保持每种细胞类型的特性。在MCF-7培养基中，hMADS细胞无法维持。然而，我们能够在前脂肪细胞培养基中维持肿瘤细胞。MCF-7细胞的性质稍有不同，但它们保留了某些重要过程的重要特征。其中一个特征是暴露于TCDD的细胞中E-钙粘蛋白降低（图S2），这是EMT的一个特征。此外，先前观察到的paxilin再定位、局灶性粘连和应力纤维的形成也是与癌症转移相关的EMT的典型现象。尽管存在一些缺点，但我们认为开发共培养模型是重要的，因为它们比类有机物更容易生成，这是另一种补充工具，允许通过涉及多种细胞类型的综合方法研究外源效应（包括药物）。然而，类有机物的缺点是不能确定哪种细胞间通讯对解释毒物的生物效应最为重要。我们在共培养模型中使用了两种BC细胞系（MCF-7和MDA-MB-231细胞）；MCF-7细胞表达雌激素和孕激素受体，一种野生型p53，而MDA-MB-231细胞缺乏这些特征。这种差异可能很重要，因为有几篇文章报道了TCDD的抗雌激素作用，因此，我们最初怀疑MDA-MB-231中雌激素受体的缺失可能影响TCDD对MCF-7细胞的作用。尽管存在差异，但我们在每个模型中都保留了一些重要的结果，包括体内转移的可能性（斑马鱼实验）。我们的模型允许研究这些贡献，同时关注肿瘤细胞及其微环境中一种关键的间充质细胞类型，即前脂肪细胞。前脂肪细胞是脂肪细胞的前体，脂肪细胞是脂肪组织的主要成分。这就是为什么要使用hMADS细胞系，一种可以分化的前脂肪细胞系。我们最近在一项临床研究中发现，TCDD与BC转移的显著风险相关，特别是在超重妇女中，这表明脂肪组织可能发挥重要作用，这一发现加强了脂肪细胞和炎症可能是侵袭性肿瘤发展的重要因素的假设。TCDD是一种亲脂性物质，对外源性代谢以及其他持久性有机污染物具有抗性，储存在脂肪组织中。我们在C57BL/6J小鼠上使用最有效的二噁英TCDD来模拟长期生物累积分子，这些分子也刺激AhR信号通路。在先前的研究中，我们发现TCDD导致人类肝癌细胞的EMT和动物模型的肝纤维化。肝纤维化被怀疑与EMT过程有关，在肿瘤转移过程中也可以观察到EMT过程。然而，值得注意的是，AhR在肿瘤进展中的作用仍然存在争议，这可能是由于这种受体的可塑性，它能够结合多种配体，并可能以配体依赖的方式发挥作用。尽管包括我们在内的一些研究表明TCDD有利于癌细胞的迁移、侵袭和转移，其他研究表明TCDD（以及3，3′-二吲哚甲烷）可以抑制基质凝胶中不规则集落的形成，阻断体内转移，同时加速细胞迁移。在我们之前的研究中，我们发现在一些BC细胞系中，使用抑制剂或siRNA敲低基因来操纵AhR水平似乎可以减少人类细胞的侵袭、迁移和转移。关于受体作用的这一有争议的问题可能是由于多种因素（细胞培养条件、肿瘤微环境、各种AhR配体的不同作用）引起的；因此，由于AhR的作用与许多核受体一样，是脉络相关的（例如乳腺、前列腺），需要进一步的研究来阐明AhR在癌症进展和转移中的复杂作用。由于日常生活涉及多种持久性有机污染物的暴露，因此在我们的模型中描述持久性有机污染物混合物的影响对于确定它们在多大程度上刺激肿瘤进展是很重要的。此外，非持久性有机污染物的混合物，如邻苯二甲酸酯和双酚或重金属，应进行评估，即使这些外来物是非持久性的。我们的研究提供了证据，据我们所知，通过部分靶向肿瘤微环境和刺激以前未被认可的分子途径，TCDD可以促进乳腺癌细胞在斑马鱼中的转移发生。这一发现加强了一个观点，即更复杂的模型，如共培养模型或类有机物，应用于研究毒理学机制，它们也有可能用于药物或污染物的化学评估。一般来说，这些知识对于公共健康管理肿瘤来说是不重要的，因为对这一代侵袭性肿瘤的研究和评估仍然很差。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33683140/----------微科盟更多推荐----------
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