科研 | ACS Cent Sci.： 利用蛋白质静电调节细菌中生物分子缩合物的形成

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

虽然真核细胞有无数的膜状细胞器可以隔离不同的化学环境，但原核细胞缺乏这些明确的反应容器。生物分子凝聚缺少膜的细胞器提供了一种无物理屏障的细胞组织策略，同时允许细胞的动态响应组织。已经证实，本质上无序的蛋白质结构域通过液相分离驱动凝析物的形成；然而，球形蛋白结构域在细胞内相分离中的作用仍然不清楚。我们假设球状蛋白质的总电荷将决定凝析物的形成和浓度，并系统地用超电荷蛋白质和大肠杆菌中的核酸来探讨这一假设。在这项研究中，我们证明了工程蛋白和RNA之间的冷凝是通过静电相互作用形成的，而且这些冷凝是动态的，只富集特定的核酸和蛋白质成分。在此，我们提出了一个基于蛋白质电荷的简单的相分离模型，可以用来预测细胞内冷凝物的形成。有了这些指导方针，我们已经为设计可调控球状蛋白功能的合成功能性无膜细胞器铺平了道路。

论文ID

原名：Formation of Biomolecular Condensates in Bacteria by Tuning Protein Electrostatics译名：利用蛋白质静电调节细菌中生物分子缩合物的形成
期刊：ACS Central Science
IF：12.685发表时间：2020.12通讯作者：Allie C Obermeyer
通讯作者单位：哥伦比亚大学

实验设计

实验结果

1. 合成生物分子缩合物的设计与体外论证
我们定义了一个简化的系统来探测蛋白缩合物在体外的相行为。该系统由一对带相反电荷的生物大分子阳离子GFP和阴离子生物聚合物组成(图1A)。之所以选择RNA作为阴离子伴侣，是因为它分布在细菌的细胞质中，约占干细胞重量的20%。此外，RNA蛋白相互作用已被证明在体外和细胞中调节相分离。为了研究蛋白质电荷对生物大分子凝聚的影响，我们使用了7个各向同性增压绿色荧光蛋白（GFP）变体。利用这组GFP变体，我们用跨越大肠杆菌蛋白质组中观察到的电荷来测试蛋白质的行为(图1B)，其中最超载的变体带有+36电荷。我们开始了我们的体外实验，通过浊度分析探查相分离的程度。在我们的简化模型中，我们计算了细胞内环境中最丰富的自由离子：钾、钠、氯化物和磷酸盐，这些离子在细胞中的浓度都是毫摩尔。在固定的总大分子浓度下，每一个增强的GFP变体与总RNA以不同的GFP/RNA比率混合(1 mg/mL)。在模拟生理条件下，预期净电荷低于+18的变体没有与RNA相分离（补充图3）。接下来，我们探索了每个GFP变体(≥+18)的相界，该相在初始分析中分离(图1C和补充图3)。作为阴性对照，我们还建立了GFP(+12)的相图。与我们最初的分析一致，我们在所有浓度的GFP(+12)下都没有观察到相分离。相比之下，在测试的浓度和条件下，具有较高净电荷相的阳离子变体在更大范围内分离(图1C和补充图3)。当GFP电荷从+18增加到+36时，更宽的高浊度区域描述了这一点，这表明在较低浓度时，更高的净电荷变体与RNA相分离。这些样品的光学显微镜证实了浊度结果，显示在一定大分子浓度范围内，GFP(+18)呈球形液滴和液滴聚结的情况(图1C)。在模拟细胞内环境的条件下，超阳离子蛋白和RNA在体外凝聚，通过复凝聚作用生成液滴状的凝聚体。然后我们研究了这些发现是否在体内转化。我们假设，利用细胞机制产生阳离子型GFP变种将足以实现细胞内相分离，无需额外的工程。图1 工程蛋白的体外相分离
(a)大肠杆菌中阴离子核酸与阳离子工程蛋白之间的胞内复合凝聚的设计原理图。(b)蛋白质在大肠杆菌蛋白质组(UP000002032)中按期望电荷(bin宽度= 2)分布。箭头表示本研究中使用的GFPs的预测电荷。(c)在生理缓冲液(70 mM K₂HPO₄,60 mM KCl, 40 mM NaCl, pH 7.4)中按指定浓度(盒)混合纯化的GFP变体和纯化的总细胞RNA的相图(左)。阴影(在框内)表示浊度值，绿色虚线表示观察相边界，绿色阴影表示两个相区域。荧光显微镜图像显示混合物(右)。GFP(+24)和GFP(+30)的阶段图可以在支持信息中找到。比例尺，10 μm。 2.静电驱动下蛋白质凝聚的体内演示
由于RNA和带负电荷的蛋白质(图1B)构成了细胞内大分子的重要组成部分，我们假设仅阳离子型GFP变异的表达就可以在体内诱导亚细胞微组装的形成。我们进一步假设，这可以在不引入外源性阴离子伴侣或不附加相分离结构域(如内在无序多肽)的情况下完成。最后，我们假设通过我们简单的体外蛋白质-核酸模型可以预测细胞室的形成。与这些假设一致的是，我们发现在大肠杆菌中仅表达超带电的GFP(≥+12)就足以形成亚微米大小的隔间(图2A)。这些相分离的隔室代表了比周围细胞质含有更高的GFP浓度的细胞内区域。为了测试相行为对蛋白质电荷的依赖，我们在大肠杆菌细胞中过表达了每个阳离子型GFP，并在诱导GFP表达后的不同时间点用光学显微镜对细胞进行成像。在表达净电荷至少为+12的GFP细胞中，我们主要观察到隔室形成，这与体外观察到的趋势基本一致(图2)。相反，在诱导24小时后，表达带负电荷的GFP（sfGFP）和净电荷为+6或以下的变体细胞中，GFP在整个细胞长度上的分布较为均匀(补充图4-9)。为了控制蛋白质增压对细胞内隔室形成的影响，我们表达了一种电荷为−30的超阴离子GFP变体。我们观察到每个细胞内GFP分布均匀，这表明仅仅增压不足以形成冷凝物，还需要阳离子蛋白(补充图4,9)。考虑到细胞中有大量的负离子细菌蛋白和多负离子(如DNA和RNA)，这一发现并不特别令人惊讶。然后，通过分析每个GFP变体沿内侧细胞轴的空间分布，我们对这些观察结果进行量化(图2B)。sfGFP和GFP(+36)在空间分布上存在显著差异，图像分析证实sfGFP均匀分布于整个细胞长度，而GFP(+36)集中在极点。我们的结果表明，GFP在细胞中的分布依赖于蛋白质的电荷。随着蛋白质净电荷的增加，GFP的异质分布变得更加明显，中间电荷GFP变体的细胞中心荧光强度降低(图2A和补充图4 9)。在诱导后24小时，GFP的定位也随着增压的增加而发生转变。随着蛋白质电荷的增加，细胞分布从均匀的(GFP(+6))，到三个局部凝析物(GFP(+12))，再到两个局部的极点凝析物(GFP(≥+ 18)，图2C)。此外，随着蛋白电荷在+18以上的增加，细胞质和凝析物之间的浓度差增加(补充图10)。这一证据表明，具有较高净电荷的蛋白质离临界点更远，导致稀相和凝聚相之间存在较大的浓度差异。混合分布代表了中间的GFP分布，这种浓度差异是最小的。相分离凝析物的形成不仅取决于蛋白质的电荷，还取决于蛋白质表达的时间。我们在诱导GFP表达后2、8和24 h对表达GFP(+6)的细胞进行成像分析。在此期间，我们观察到细胞内GFP浓度增加(补充图11)，并在2至8小时内观察到均匀分布向非均匀分布过渡。随着细胞内GFP(+6)浓度的持续增加，在诱导后24小时，细胞恢复到均匀分布(补充图4,9和12)。同样，在短时间内，所有的GFP变体要么在细胞质中呈均匀分布，要么呈杂交分布，但GFP的浓度与细胞质相似。在随后的时间点，随着蛋白质浓度的增加，冷凝物要么形成，要么变得更明显。细胞内相分离对大多数超荷型GFP变异的细胞活力和表达的影响都很小。25℃下的生长试验表明，在蛋白表达诱导后的前8小时，表达超阳离子GFP的细胞与表达sfGFP的细胞生长相似。在较长的时间点上，所有阳离子型都表现出轻微的增长抑制(补充图11)。重要的是，冷凝物的形成并不影响细胞形态，并导致细胞长度的微小差异(补充图13,16)。同样，诱导后24小时，每个变异细胞的GFP浓度都有所增加，通过归一化到细胞密度的荧光强度进行监测(补充图4)。总的来说，除GFP(+30)和GFP(+6)外，所有GFP变体的归一化荧光随时间的增加具有可比性。GFP(+30)始终表现出最低的光密度和最低的归一化荧光强度(补充图11)。此外，表达GFP(+30)的细胞在8小时后形成的凝聚比表达GFP(+24)和GFP(+36)的细胞更不明显(补充图5和7)。总之，GFP(+30)在细胞内冷凝物形成过程中并没有遵循预测的趋势，尽管体外实验表明并非如此。GFP(+30)可能在细胞中表达较差，无法达到形成更大凝析物所需的细胞内GFP浓度。而GFP(+6)在归一化GFP荧光中增幅最大。有趣的是，这些荧光的大幅增加可能有助于解释表达GFP(+6)的细胞在8小时可逆形成隔间，并在24小时溶解(补充图4,9和12)。使用归一化荧光作为每个细胞GFP浓度的代用指标，我们假设当GFP(+6)浓度增加时，细胞中的蛋白质浓度可能在8小时穿过相边界进入混合状态(补充图4,5,11)。当胞内GFP(+6)浓度进一步升高后，24小时后胞室消失，对应细胞内GFP浓度再次越过相边界，回到单相状态(补充图5和图6)。由于GFP(+6)在我们的体外实验中没有与RNA相分离，我们无法在体外证明相界的穿越。然而，我们对真核细胞中GFP(+6)缩合物的体内形成和溶解以及无膜细胞器可逆相变的观察表明，在实验过程中，细胞生长周期中细胞质大分子浓度的变化可能使细胞穿越相边界。综上所述，我们的体内实验结果表明，在大肠杆菌中蛋白密集室的形成依赖于蛋白质的电荷和浓度。我们还证明了细胞内GFP浓度变化导致细胞内腔室形成的可逆性，初步证明了腔室可能来自于蛋白相分离。此外，细胞内蛋白冷凝物的形成与我们体外蛋白- RNA模型的趋势一致，这表明我们的模型可以预测工程细胞内冷凝物的形成。 图2 阳离子绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的相分离
(a)诱导24小时后表达不同净电荷的GFP变异细胞的荧光显微镜图像。负电荷或中性变异体(左)均匀分布于整个细胞，而超离子变异体显示点状荧光定位于细胞极点(右)。随着阳离子电荷的增加，荧光的定位更加明确，例如在中间电荷的GFP变体(中间柱)中观察到的电荷依赖性定位增加。比例尺，2 μm。(b)从显微镜图像中定量sfGFP和GFP(+36)的定位模式，如(a)所示。使用microbeJ生成代表长细胞轴上绿色荧光蛋白强度的垂直热图。统计学显示了按细胞长度排列的细胞群的GFP强度。(c)当GFP归一化到细胞位置时，GFP电荷达到+12和+18时发生了转变。每条线代表归一化的中间荧光相对于归一化的细胞位置，阴影区域代表观察值的SEM。对于(b)和(c)，进行了三个独立的实验，每个实验至少分析120个细胞。对所有GFP变体的分析见补充图4-9。 3. 凝聚相是动态的并且有别于包涵体
我们接着对这些蛋白缩合物的性质和被封装的增压GFP动力学进行了表征。关于细菌中冷凝物形成的文献仍然很少，但是最近的报道已经阐明了新月形芽孢杆菌中由RNase E形成的内源性冷凝物(BR体)，它包含相分离所必需的非结构化结构域。除了BR小体外，在表达重组蛋白时还会形成不可溶的、错误折叠的蛋白质隔间，称为包涵体(IBs)。为了区分相分离缩合物与其他细菌室，我们研究了缩合物的溶解度和细胞内蛋白质动力学。通过检测细胞腔的溶解度，探讨了细胞腔的凝聚态性质。我们假设，作为基于蛋白质的复合物凝聚体，由于溶液中离子对静电相互作用的筛选，细胞内的凝聚物将可溶于高离子强度的缓冲液中。相反，电荷筛选对包涵体（IBs）的溶解影响很小，IBs是由部分折叠的重组蛋白聚集形成的。IB的溶解需要用尿素等共沸物变性部分和错误折叠的蛋白质。为了区分细胞内隔间和IBs在溶解度上的差异，我们通过删除GFPβ-barrel的疏水环(GPVLLP)，设计了一个内含体形成的阳离子型GFP变体，IB-GFP(+36)。作为额外的对照，还测试了链霉亲和素(一种在大肠杆菌中重组表达后形成IBs的蛋白)的溶解度。IBGFP(+ 36)和链霉亲和素在溶解度上的相似性表明IBGFP(+ 36)形成不溶性聚集体(补充图17和18)。我们对表现出显著表型差异的GFP变体sfGFP、凝聚型GFP(+36)和包体型IB-GFP(+36)进行了可溶性比较研究。每个GFP变异表达后，收集细胞，裂解，离心，从致密的不溶性成分中分离可溶性蛋白部分。在标准的蛋白纯化条件下，IBs分离成不溶性部分，我们假设密集的GFP也会凝聚。不溶性组分被清洗以去除残留的可溶性蛋白，并用低盐、1 M NaCl或8 M尿素缓冲液处理，处理后收集可溶性和残留不溶性成分，通过SDS-PAGE分析各组分中GFP的含量(图3A和补充图17)。溶解度的差异表明阳离子GFPs形成了不同于包涵体的隔室。隔室形成的GFP变体很难在低离子强度的缓冲液中溶解，而sfGFP可溶于所有测试的缓冲液中(图3A)。高离子强度缓冲液提取GFP(+36)的比例(0.9)明显高于尿素(0.05)。这表明这些隔间的溶解度需要增加离子强度，为复杂类似凝聚物的性质提供了进一步的证据。而提取的IB-GFP(+36)在8 M尿素缓冲液中比例最高(0.9)，在1 M NaCl缓冲液中比例明显较低(0.1)，说明包涵体需要尿素变性蛋白。综上所述，这些溶解度测定为GFP（+36）形成的细胞内腔室的凝聚相行为提供了证据，并将这些蛋白质凝聚物与包涵体区分开来。由细胞内GFP(+36)形成的蛋白质凝聚物主要是GFP密集的，这与体外蛋白质包封实验一致，其中凝聚相可以有效地包封蛋白质核酸混合物中90%以上的蛋白质。在我们的溶解度测定中，大部分GFP(+36)是在用1 M NaCl溶解后提取出来的，通过SDSPAGE分析可以观察到很少的GFP残留在颗粒中(补充图17)。这些结果表明，蛋白质增压可能为在胞内隔间中富集重组表达蛋白提供了一种策略。此外，凝胶分析显示，在高盐条件下溶解的蛋白绝大多数是GFP。这些结果也表明，在没有固有的生物分子特异性的情况下，可以实现选择性缩合。为了进一步证明GFP增压形成的室间是能够动态重组的共凝物，我们采用光漂白后荧光恢复(FRAP)技术监测GFP分子在室间的扩散情况。将细胞在一极漂白，随着时间的推移监测漂白冷凝物的荧光强度(图3B)。单指数拟合结果显示，GFP(+12)的平均采收率最快(t_1/2 ≈4 s)，平均流动分数最高(0.5)(补充图19-21)。此外，在褪色（Bleaching）约1分钟后的显微镜图像中可以看到GFP荧光的恢复，并且同一细胞内相邻凝析液的荧光明显下降，表明GFP在凝析液之间扩散。GFP在凝析物之间的扩散随着蛋白质增压的增加而降低。随着蛋白质净电荷的增加，流动分数降低，回收半衰期增加(图3B)。为了进一步区分与阳离子蛋白形成的区隔，我们还检测了包囊体形成GFP和sfGFP的动态。以IB-GFP(+12)为阴性对照，漂白后未恢复。同样，额外的阴性对照也很容易发生光敏漂白，且未恢复(参见补充图20-21中的IB-GFP(+18)和IBGFP(+ 36))。这与其他关于哺乳动物细胞内包涵体光褪色的报道一致，这些报道没有观察到物质交换。表达sfGFP的细胞立即显示出完全的褪色，并且没有明显的恢复(补充图19和21)。由于GFP的快速扩散导致整个细胞褪色，因此没有观察到恢复。激光设置和褪色时间对增压的GFP变种进行了优化，并提供了足够的漂白，以观察到GFP扩散到褪色区域。总的来说，蛋白质溶解性和FRAP实验表明，GFP(+36)形成的隔间可能来自与复杂凝聚相一致的静电相互作用。溶解度测定显示凝聚相致密，需要不同于普通不溶性细菌包涵体的溶解机制。此外，通过FRAP的分析证实，凝聚相能够通过周围的细胞质进行物质交换，动态交换依赖于蛋白质电荷。 图3 荧光点状物表现为复杂的凝聚物
(a)表达工程GFP的裂解大肠杆菌细胞的致密、不溶性部分被溶解在一系列缓冲液中，以区别阳离子型GFP(+36)和包内含体(IB)形成变体的行为。不溶部分用裂解缓冲液、1m NaCl或8m尿素处理，用SDSPAGE分析测定各处理后GFP(sfGFP、GFP(+36)或IBGFP(+ 36))的溶解分数。(b)将大肠杆菌细胞的一端褪色，并随时间监测荧光的恢复情况(左)。面板显示了一个表达GFP(+12)的代表性细胞在FRAP不同时间点的荧光(右)。增压的GFP液滴相对于IB形成的GFP是动态的，并随着蛋白质电荷的增加而变得不那么动态。比例尺，1 μm。
4. 工程蛋白缩合物中内源性生物分子的鉴定
由于内源性核酸和蛋白质参与并调控细胞内的缩合，我们推测除了阳离子型GFP外，内源性生物大分子也会定位于工程缩合物。为了表征凝析物的组成，我们结合核酸染色和蛋白质组学分析来鉴定参与或分割到凝析物相的成分。核酸在驱动蛋白相分离中的作用已经在体内和体外报道。我们用DNA (DAPI)或普通核酸染色(SYTO17)对表达GFP(+36)的细胞进行染色，研究蛋白凝析物的核酸成分。DAPI染色显示DNA被排除在凝聚期之外(图4A)。DNA位于细胞中心并被排除在GFP极点冷凝物之外。然而，GFP(+36)凝析物和SYTO17染料之间的空间重叠表明，与DNA不同，RNA与蛋白质凝析物共聚，并可能是其中的一个组成部分(图4B和补充图22)。在整个细胞的工程蛋白凝聚物中鉴定内源性生物分子，表明sfGFP与DNA和RNA共定位。虽然核酸已被报道为生物分子相分离的主要参与者，但蛋白质间微弱的、短暂的相互作用也被证明会引起生物分子的凝聚。此外，对大肠杆菌蛋白质组的分析表明，蛋白质预期电荷的频率分布（图1B）是倾斜的，使得蛋白质组是净负电荷。因此，我们假设蛋白质在体内也可能作为超离子GFPs的阴离子对应物发挥作用。我们对GFP(+36)缩合物的蛋白质组成进行了定量蛋白质组学分析。在高盐条件下，我们从含有GFP-(+36)基凝聚相的不溶性部分提取的蛋白与低盐提取分离的蛋白进行了比较(补充图23)。由于凝析液中高浓度的GFP(+36)可以掩盖其他蛋白质的存在，因此我们用亲和层析法从样品中去除GFP(+36)。我们通过蛋白质组学鉴定出约1100个蛋白质，其中450个蛋白质在提取的凝析物中轻度富集(>1倍)，只有30个蛋白质显著富集(>2倍)(图5A和补充数据S1)。许多核糖体结合蛋白被鉴定出来，但在随后的分析中被排除，因为它们很容易通过温和的盐分离从不溶性部分中提取。此外，核糖体蛋白的富集也可以解释为它们的高丰度或静电与阳离子GFP的关联。正电荷和负电荷蛋白都在凝析物中富集，其中阴离子蛋白hldD富集程度最高(9倍)。为了验证我们的定量蛋白质组学结果，我们将几个鉴定的蛋白质与mScarlet-I融合，以评估GFP(+36)凝聚物在细胞内的共定位。我们选择用于验证实验的蛋白质跨越近两个数量级的富集：ADP-L-丙三基-D-manno-庚糖-6-差向异构酶 (hldD)、核糖核酸酶活性调节因子A（rraA）、核糖核酸酶R（rnr）、核糖核酸酶活性调节因子B（rraB）、肠毒素A/B（ecnAB）和生物合成精氨酸脱羧酶（speA）（图5A）。在测试的融合物中，有两个与GFP凝聚物共域。当与mScarlet-I融合时，表现出最高折叠变化(hldD)和与GFP(+36)共定位的负离子蛋白(rraB)的蛋白质缩合物(图5B)。有趣的是，hldD参与了脂多糖核心的生物合成，有报道称，在热休克诱导的高温下，hldD促进大肠杆菌的生存能力。真核细胞中的蛋白质可以通过形成生物分子缩合物，在暴露于环境压力源时产生适应性反应。对于酵母中的聚a结合蛋白(Pab1)，在长时间的热胁迫下，Pab1通过蛋白间相互作用相分离提高了机体的适应性。另一种蛋白质，rraB，通过抑制RNase E和阻止特定RNA转录物的降解来调节细胞内RNA丰度。更令人兴奋的是，RNase E参与了最近发现的细菌凝析物(BR-bodies)的形成和降解功能，这些凝析物隔离并控制C. crescentus的RNA降解。同样的研究还表明，BR小体可以促进细胞在急性乙醇胁迫下的生长。我们需要更全面的研究来了解hldD和rraB在我们设计的GFP冷凝液中的存在和作用。然而，它们在功能上与其他生物中负责细胞内相分离的蛋白相似，这也表明hldD和rraB是大肠杆菌内源性生物分子缩合物的候选分子。相反，rraA-mScarlet-I没有表现出空间偏好，并且表现出与对照样品相似的分布曲线，其中mScarlet-I与GFP（+36）共表达(图4D和补充图24)。共表达控制显示mScarlet-I在整个细胞内均匀分布，而GFP(+36)在两极的分布不均匀。这些结果表明，mScarlet-I的表达不影响GFP(+36)的定位，并且mScarlet-I在hldD-和rraB -mScarlet-I样品的极处共定位不是表达系统的产物。此外，rraA通过结合和抑制RNaseE活性来控制mRNA丰度;然而，rraA调节的RNA转录组不同于那些rraB。缺乏空间偏好表明rraA融合可能比rraB融合对凝聚相组分的相互作用有更低的偏好。其余的蛋白融合(ecnAB-， speA-，和rnrmScarlet- I)没有与GFP(+36)缩合物共域。由于ecnAB是一种定位于细胞膜的细菌脂蛋白，mScarlet-I融合物在GFP凝析物两侧显示荧光(补充图24)。SpeA被用作阴性对照，因为它被蛋白质组学鉴定出来，但在凝析液中没有富集，尽管是超阴离子(预期电荷-41)。正如预测的那样，speA-mScarlet-I没有被观察到共定位，其中融合蛋白主要定位于细胞中心，部分排除在两极之外。令人惊讶的是，rnrmScarlet-Ⅰ也被排除在GFP凝集物之外，尽管它在高盐部分富集3.6倍。Rnr在生理pH下的预期电荷为+9.6。由于缩合物主要由超阳离子GFP组成，我们假设Rnr-mScarlet-I不利于分配到凝聚物中，因为它在与阴离子大分子的有吸引力相互作用中会被超阳离子GFP竞争。此外，与蛋白质组学鉴定的核糖体结合蛋白一样，rnr在高盐存在下很容易溶解，这可以解释其富集现象。mScarlet-I融合蛋白也与sfGFP共表达（补充图24）。所有mScarlet-I融合的荧光强度分布均与sfGFP的均匀分布相关，除了ecnAB-mScarlet-I定位于膜上。空间分布的相似性提供了进一步的证据，表明融合蛋白与凝析物的共位点不是我们选择的表达系统的人为产物。此外，虽然在我们的人工表达系统中观察到mScarlet-I融合的均匀分布，但需要注意的是，这些天然蛋白可能在生理表达水平上形成冷凝物。虽然我们已经验证了mScarlet-I融合与GFP(+36)共域，但我们不能排除这些天然蛋白在缺乏阳离子GFP和/或天然表达水平下形成冷凝的可能性。此外，speAmScarlet- I与sfGFP的共表达通常产生更宽更长的细胞。一小部分表达speA-mScarlet-I的细胞也表现出最小的sfGFP荧光，并在细胞内的非特异性区域排除融合蛋白。然而，speA-mScarlet-I与GFP(+36)的共表达使细胞体积缩小至mScarlet-I对照组。这表明当与GFP(+36)共表达时，表达speA-mScarlet-I的细胞负担减轻，并且从冷凝液中排除speA-mScarlet-I不是伪效应。静电表面图显示，在凝析液中富集的蛋白质在暴露于溶剂的表面通常含有高阴离子电荷密度的局部区域(补充图25)。这些高负电荷区域更有利于与阳离子GFP进行静电相互作用，并与凝析物共域。相反，相比之下，SpeA(阴性对照)同时包含阴离子和阳离子，彼此接近。我们假设，与富集蛋白不同，speA可能更喜欢与自身相互作用，而不是与阳离子GFP分子间相互作用。对富含GFP凝析物的其他内源性蛋白质的验证可能有助于进一步深入了解促进细胞内复合凝析的蛋白质特性。体内核酸染色和定量蛋白质组学研究表明，合成的GFP凝析物在核酸和蛋白质组成上具有选择性。我们用GFP缩合物对核酸染料进行共定位分析，发现DNA被排除，RNA被纳入到隔室中，支持我们的简单体外RNA -蛋白模型(图1A)。此外，通过高盐分馏和定量蛋白质组学对蛋白质成分的鉴定表明，高电荷的内源性蛋白质与RNA一起存在于缩合物中。蛋白质组学候选物的验证跨越了一系列的折叠富集和预期电荷，为高电荷内源性蛋白质参与和/或分配到凝聚相提供了进一步的证据。图4 内源性核酸与阳离子GFP缩合物的共定位
(a)用DAPI(一种DNA特异性染料)对细胞进行染色，评估DNA与GFP(+36)凝析物的共定位。显微镜图像显示表达GFP(+36)或sfGFP的细胞，并用DAPI染色。强度线切割表明从GFP(+36)凝聚物中排除了DNA。(b)通过SYTO 17染色细胞来评估RNA与GFP(+36)凝析物的共定位，SYTO 17结合了DNA和RNA。用SYTO 17染色的表达GFP(+36)或sfGFP的细胞显微镜图像显示了RNA和GFP共定位的强度线切线。比例尺，2 μm。 图5 内源性蛋白质与阳离子GFP缩合物的共定位
(a)高盐分离富集的裂解大肠杆菌细胞中的蛋白质用LC MS/MS进行定量。(b)从(a)中选取的蛋白质与GFP(+36)作为mScarlet-I融合物共表达。荧光显微镜和强度线切割显示GFP(+36)与hldD和rraB mScarlet-I融合共定位。在补充图23中可以找到其他的共表达式数据。比例尺，2 μm。

结论

综上所述，我们已经开发了一种很有前途的方法来在大肠杆菌中进行工程动态缩合，使外源表达蛋白的表面电荷增加。据我们所知，还没有人尝试过在细菌中制造复杂凝聚物。我们证明了凝析物的形成依赖于蛋白质的超充电程度和表达蛋白的细胞内浓度。缩合物的特征表明，它们是通过静电相互作用结合在一起的，由RNA和内源性蛋白质组成，但不包括DNA。此外，我们还表明，当与总RNA混合时，每个增压蛋白变体形成缩合物的倾向可以近似于其体外相行为。细胞内的凝聚相显示出可逆的形成，可调的动力学，选择性的生物分子掺入，以及增压蛋白的显著富集。这些特性突出了工程功能细胞内冷凝物作为生物反应器、细胞内蛋白质仓库或生物传感器的巨大潜力。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33376791/

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