科研 | Front. Cell Dev. Biol.：研究者揭示严重脂肪变性在肝移植失败中的分子致病机理（国人佳作）

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编译：微科盟晨晓曦，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读原位肝移植（OLT）是治疗终末期肝病、肝胆恶性肿瘤和急慢性肝功能衰竭最有效的方法之一，同种异体移植的质量直接影响患者的预后，作者先前研究揭示了在术后短时间内，严重脂肪变性（MaS）对严重肝损害的受体移植物衰竭（GF）的危害增加，其内部机制模糊。为进一步探讨MaS对供者GF的分子机制，并从组学角度建立移植后预后预测模型，作者采用超高效液相色谱-质谱联用技术，对82例多中心肝移植患者的移植组织进行代谢组学分析，其中路径分析采用在线工具Metaboanalyst（V3.0）进行；此外，作者采用cox比例分析法，结合代谢组学和临床资料，建立了预测模型。结果表明与MaS和GF相关的差异代谢产物在甘油磷脂代谢途径上显著富集（P<0.05）；参与甘油磷脂代谢的磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）在MaS供体和GF供体中显著降低（P<0.05）；通过组合模型（曲线下面积=0.91）观察到对移植物存活的更好预测，并通过内部验证得到了证实。

论文ID

原名：Metabonomic Profile of Macrosteatotic Allografts for Orthotopic Liver Transplantation in Patients With Initial Poor Function: Mechanistic Investigation and Prognostic Prediction译名：初发功能差的原位肝移植患者严重脂肪变性同种异体移植物的代谢组学特征：机制研究和预后预测
期刊：Frontiers in cell and developmental biology
IF：5.204发表时间：2020.08通讯作者：刘征涛、郑树森、耿磊通讯作者单位：浙江大学医学院

实验设计

实验结果

1.入选患者的临床特征
相对于肝脏利用率的稳定趋势，MaS的捐献同种异体移植从2015年的15％显著增加到2019年的25％以上。82名移植后IPF患者被纳入最终分析，如表1所示，接受代谢组学分析的移植物中MaS患病率约为42.6％。在大多数方面，同种异体脂肪变性分类的患者差异不显著（P>0.05）。仅在MaS中观察到抗HCV阳性，而在非MaS移植物中未观察到。使用MaS移植进行LT的患者WIT较短（P <0.05）。且同种异体脂肪变性分类的患者差异不明显（P> 0.05）。在医疗中心分类组中，我们观察到患者状态（年龄，性别，血型等）和疾病严重程度（Child-Pugh / MELD评分）的分布差异不显著（P> 0.05）。表1 按同种异体移植MaS状态分类的移植病例临床信息总结                            
2.移植失败的临床预测因素
在多变量cox比例风险模型中，受者的临床因素（术前Child-Pugh / MELD评分、身高、术后AST水平）、供体（术前ALT）、移植物（血脂过多）和手术（失血/输血）方面的临床因素通常会影响多位移植物的存活（图1）。图1 多协变量分析后与移植后移植物失败显著相关的因素
AST，天冬氨酸转氨酶；D，供体；EAD，早期同种异体移植功能障碍；FIB，纤维蛋白原；HR，危险比；R，受体；RBC，红细胞；S，脂肪变性
3.供体肝脏的代谢组学特征
原始数据通过QC样本根据预定义的标准被调整，通过Progenesis QI（v2.3）进行数据预处理后，每个样品总共被检测到3444种代谢物。最后，人类代谢组数据库中具有识别功能的2155个特征被纳入进一步分析。
4.捐助者肝脏的多元分析（MVA）
OPLS-DA模型中的多变量分析显示，MaS和非MaS移植物之间的代谢组学特征明确分离（Q [2] = 0.58，R [2] = 0.52，图2A）。同时，排列检验模型进一步验证了患者分类的特异性和可靠性（R [2] = 0.41，Q [2] = 0.441，图2B）。图2 MaS状态下供肝代谢曲线的多变量数据分析
（A） PCA分析显示接受MaS（蓝点）和非MaS（绿点）同种异体移植的患者通过OPLS-DA模型进行了明确的分离；（B）通过面板（A）的类别排列分析验证了OPLS-DA模型。
5.与供体MaS和移植失败相关的潜在代谢物的网络分析
通过单变量ANOVA分析，我们观察到MaS和非MaS同种异体移植物中389种代谢物差异显著（图3和表2）。进一步的功能途径分析表明，MaS引起的分化代谢产物主要参与了亚油酸和甘油磷脂的代谢（P<0.05，图3）。在MaS供体中，亚油酸水平显著升高，但磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺水平降低（P<0.05）。我们采用单变量Cox分析发现 104种代谢特征显着影响移植物的存活，其中包括91种有害代谢物和13种保护性代谢物（图3）。候选代谢产物的富集表明类固醇生物合成途径对移植后预后的重要性（P<0.05，图3），大多数涉及的特征可以归类为类固醇类，并对移植后的预后产生有害影响。经KEGG-IDs分类，包括磷脂酰胆碱（C00157）、磷脂酰乙醇胺（C00350）、糖精平（C00449）和葡萄糖醛酸苷（C03033）在内的化合物是重叠的代谢组簇，与移植后预后和供者MaS有关。C03033增加了发生MaS和GF的风险，而C00157和C00350对以上两个事件发挥了保护作用（图3）。网络分析表明，重叠的代谢物在甘油磷脂代谢途径上显著富集（P <0.01）。图3 基于与供体MaS、移植物衰竭及其交叉相关的代谢物的途径富集
（A）区分MaS移植物中具有显著增量（红色条，n=180）或减量（蓝色条，n=211）的成分的条形图；（B）MaS移植物和非MaS移植物之间的FC和每个代谢物的显著性对比的火山图，红色点代表MaS移植物中显著更高的代谢物（FC>2，P<0.05），蓝点代表MaS移植物的代谢产物显著降低（FC<0.5，P<0.05）；（C）条形图区分具有显著危险性的成分（蓝条，n=13）或对移植物衰竭的保护作用（红条，n=91）；（D）HR和每个代谢物的显著性的火山图；（E）结果基于代谢产物的途径富集在MaS和非MaS移植物之间存在差异；（F）亚油酸代谢途径和供体MaS相关代谢物的详细信息；（G）甘油磷脂代谢途径和供体MaS相关代谢物的详细信息；（H）基于移植失败单变量cox比例分析中差异代谢物的途径富集结果；（I）类固醇生物合成和移植物衰竭相关代谢物的细节；（J）接受MaS移植物的亚组患者或发生移植物衰竭的病例的标准化PC/PE比率；（K）结果以E和H交叉代谢产物为基础的途径富集；（1）MaS相关移植失败的甘油磷脂代谢途径及相关代谢产物的详细信息；（M）代谢产物都与MaS和移植物衰竭有关。
表2 导致供者MaS和移植物衰竭的候选途径中潜在代谢物的总结 
6.选择候选者进行预后分析
作者将先前单因素分析中的阳性临床和代谢组学阳性变量放入LASSO回归模型中以进行数据集的降维，筛选出包括23种代谢组学和9种临床特征的32个因素以进行进一步分析。结果显示其中15种因素（包括10种代谢组学和5种临床特征）具有最高的敏感性，为移植后预后的进一步预测模型。
7.结合临床和代谢组学特征的潜在模型对预后的预测
在多协变量Cox回归中具有统计学意义的15个因素被纳入到移植后预后的临床代谢预测模型的构建中（图4），在发生EAD或使用MaS供体的EAD患者中观察到明显较高的GF风险（分别为HR = 4.37 / 5.62）。已入药的易感代谢物大多数可分别分为脂质和有机酸类别。根据临床代谢模型，C00157化合物[PC（18：4/16：0）]发挥保护作用，而地塞米松（HMDB0015364）作为外源糖皮质激素在LT术后不良预后中起危害作用（HR = 0.28和4.13）。苏氨酸脯氨酸和PA（15：0/18：4）的危害作用达到高峰后继续保持在较高水平。作为外来物质的地塞米松和N-丙二酸在50％和37％的同种异体移植物中无法检测到，但我们发现一旦在其余位置检测到GF的风险会迅速增加。
8.诺模图预测移植后移植物衰竭
在考克斯回归模型中，与GF显著相关的15个因素（10个代谢组学和5个临床因素）被整合到不同时间段移植后移植物存活的预测列线图中（图4）。诺模图的一致性指数为0.85（95％CI：0.79 0.91）。校正图显示移植后存活的观察和预测风险之间有很好的一致性。我们在热图中观察到的较低的相关性，所有入选的因素相对独立（所有r<0.4，图4）。
9.诺模图在预后预测中的应用
作者根据上述诺模图算法提取的临床、代谢和组合因子聚类，分别评估预测模型的效率。同时，这些亚组对移植后生长因子的影响也按医学中心划分的亚组被评估。预测总移植物存活率的AUC为0.69（95%CI:0.58−0.79），0.85（95%置信区间：0.75−0.92）和0.91（95%CI:0.83）−0.96），用于临床、代谢和组合模型（图4）。基于诺模图算法的临床、代谢组学和组合因素，移植后GF的持续时间依赖性AUC也在延长至3年的登记患者中被评估（图4）。随着存活时间的延长，临床聚类（包括受体、移植物和手术因素）对移植后GF的预测准确率迅速下降。GF预测的AUC从180天的0.81下降到3年存活的0.67。与临床组群相比，代谢组群在GF预测上更稳定，不同时间点的波动较小（AUC在0.83～0.87之间）。临床代谢组学模型预测GF的敏感性和特异性在最佳临界值下分别达到0.93和0.81。与之相比，在相同的临床预测模型条件下，Youden指数仅为0.32，敏感性相对较高（0.99），特异性较低（0.33）。代谢组学数据的参与显著提高了移植后GF预测模型的效率。图4 临床代谢模型对移植后预后的预测作用
（A）单变量分析中所选因子的Lasso系数分布；（B）最小准则交叉验证的最优参数选择；（C）通过cox比例分析构建GF发生预测模型的潜在候选森林图；（D）基于候选临床和代谢因素的GF预测诺模图；（E）不同时间点预测和实际GF之间关联的校正曲线；（F）对潜在的临床和代谢协变量进行成对相关分析的热图；（G）不同模型（临床模型、代谢模型和组合模型）在B组LT患者GF预测中的应用；（H）所有肝纤维化患者中不同模型对肝纤维化预测的时间依赖性AUROC值；（I）A组中不同模型对肝纤维化预测的时间依赖性AUROC值；（J）不同模型对B组（K）LT患者GF预测的时间依赖性AUROC值。图5 通过GLS和RCS模型连续协变量对移植失败的剂量反应效应
（A）精氨琥珀酸（HMDB0000052）对GF的剂量效应；（B）PC（18:4/16:0）（HMDB0008232）对GF的剂量效应；（C）非酰基肉碱（HMDB0013288）对GF的剂量效应；（D）地塞米松（HMDB0015364）对GF的剂量效应；（E）苏氨酸脯氨酸（HMDB0029069）对GF的剂量效应；（F）枇杷苷B（HMDB0038029）对GF的剂量效应；（G）阿维菌素D（HMDB0038943）对GF的剂量效应；（H）N-丙二酰色氨酸（HMDB0039500）对GF的剂量效应；（I）30-UMP（HMDB0060282）对GF的剂量效应；（J）PA（15:0/18:4）（HMDB0114818）对GF的剂量效应；（K）失血量（每1000ml）对GF的剂量效应；（L）移植前受者child-pugh评分；（M）受者身高（cm）对GF的剂量反应效应。

讨论

肝移植作为终末期肝病的“最后手段”，其质量受到供体、受体、器官、手术等多方面因素的影响。更多的次优器官被投入使用，以缓解器官供应有限和对肝移植需求增加之间的矛盾。作为ECDs最常见的特征之一，接受严重MaS同种异体移植的患者预后较差，并伴有更多的并发症和移植失败。由于PODs暂时性肝功能不全，最初的肝功能不良（IPF）被认为是受供体、受体、移植物和手术的影响。通常，通过1个月内的强化支持，IPF是可逆的，但通过与供体MaS整合，IPF患者的GF风险会增加。作者推测某些代谢产物是生物化学和生理过程的下游产物，可能是由MaS供体引起的GF额外风险的原因。基于LT后同种异体移植的IPF代谢组学数据，作者发现以下几点：①富含甘油磷脂代谢途径的代谢产物影响供体MaS和移植物存活；②磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的分子减少是对调节供体MaS和移植物损失的关键；③组合的临床代谢模型（包括10种代谢物和5种临床指标）在LT后的3年内对GF的预测性能有所改善。此外，验证测试也证实了该模型在预后预测中的可靠性。作者研究发现，在IPF患者中，供体MaS的发生率很高（>40%）。MaS器官的HCV感染更多，缺血的时间更长（P＜0.05）。 MaS同种异体移植物的使用随着时间的推移而增加。作者对NAFLD / NASH患者血清、血浆、尿液、肝组织甚至唾液样本进行代谢组学分析，揭示了其机制并评估了对肝脂肪变性的药物治疗效率。但是，对以前通过MaS状态区分的移植物进行的代谢组学分析较少。众所周知，在体外，MaS器官的代谢组学变化对于来自缺血再灌注损伤的更高压力而言更为复杂。因此，有必要进行代谢组学研究来阐明LT的MaS移植物的代谢特征。作者研究发现脂质代谢的变化在调节肝移植肝甘油三酯含量（HTGC）中起着主导作用。通过对肝移植肝组织的分析，可以清楚地区分供者的MaS状态（图2）。关键分子在亚油酸和甘油磷脂代谢途径上富集，其中亚油酸（LC）是一种仅从饮食中提取的必需脂肪酸，在体内与n3-PUFA存在一点关系。先前的研究发现，亚油酸（LC）作为“omega-6”多不饱和脂肪酸（n-6 PUFA）是一种仅源自饮食的必需脂肪酸，在体内与n-3 PUFA有关。磷脂酰胆碱（PC）作为游离胆固醇（FC）的拮抗剂被下调，对LC的产生具有负调控作用。值得注意的是，PC是连接亚油酸和甘油磷脂代谢的中枢枢纽。同时，PE的程度也有所降低（FC分别为0.31和0.29，而PC为0.45），导致PC / PE比增加，表明整个移植物中脂肪肝相对较轻。此外，增加的溶血磷脂（LysoPC）作为氧化应激和促炎状态的指示也参与了发病过程。网络分析显示MaS移植组织的代谢组学变化与NAFLD/NASH患者活检组织相似。对移植后移植物存活有危险影响的六种脂质代谢物在类固醇生物合成途径上显著富集（P<0.05，图4和表2）。研究发现内源性类固醇失调也应该引起关注，以改善移植后的预后作用。目前较少研究集中于与GF发生同时相关的MaS相关代谢物上。作者收集了与MaS和GF相关的代谢物簇之间的交叉点，其中交叉化合物被认为是连接MaS和GF的桥梁。结果表明甘油磷脂代谢途径对MaS相关GF具有重要意义（图4）。作为细胞膜的主要成分，甘油磷脂稳态的紊乱可能通过增强的肝炎症来介导肝脂肪变性的发展。但是，以前从未报道过甘油供体与供体MaS和移植后GF的关系。在我们的研究中，PC和PE是甘油磷脂代谢的关键节点，只是与LT后不良预后负相关的两个分子。标准化的PC/PE比从1.5降至0.76。结果表明，降低的PC/PE比及其指示性的膜完整性丧失和更严重的肝炎症可能与致死性发病机理有关。同种异体移植的质量可以通过PC补充剂来改善，该补充剂已用于NASH患者。离散分子主要通过相互之间较低的相互作用而属于脂质和有机酸类别（表3），外部物质如地塞米松或N-丙二酸甲基色氨酸含量最高的器官的移植失败率更高，所有糖皮质激素残留量极高（最高10％）的器官都是DCD供体的移植物。先前研究发现地塞米松对大鼠模型的移植后细胞周期初始进程具有抑制作用。作者推测，外部化合物含量升高是移植物排毒功能差的指标，而GF预后的可能性也很高。先前研究试图基于从代谢组学/脂质组学获得的分子来预测短期结果（EAD，PNF和3个月死亡率），但很少有研究来评估代谢组学数据对移植后结局的预测效率。研究发现整合模型是结合代谢组学和围手术期因素的，这些因素与接受者（身高，Child-Pugh / MELD评分，EAD），手术（失血）和同种异体移植（脂肪变性类型）相关，均基于严格的算法。与临床模型相比，整合模型的GF预测效率更高。验证测试还证实了其可靠性和有效性，可用于结果预测。该研究对象是根据近1000例发生IPF的LT病例进行选择的，可保证相似的移植后肝功能，以评估代谢组学协变量对长期预后的影响。此外，作者发现供体MaS通过与IPF结合对GF发挥最大的积极作用。MaS状态对同种异体移植物代谢组的鉴别也得到了证实。选择性发生IPF的病例可能有助于更好地阐明MaS相关机制及其与GF的关系。众所周知，LT是一项系统工程，在受体，供体，移植物和手术因素上具有复杂的相互作用。先前的研究试图建立代谢物与短期预后之间的联系，但较少提及长期结果。作者研究发现具有代谢组学和围手术期因素相结合的算法能够很好地监测长期预后。发达的机械灌注有效保留了更多功能正常的器官，并扩大了次优器官的使用范围。该研究结果可为MP的进一步治疗提供目标，以改善移植物的质量。同时，该研究的局限性也应解决。 MaS组和非MaS组之间在WIT长度，HCV患病率和随访时间方面的异质性不可避免地会产生差异。尽管这两个队列的患者似乎具有可比性，但统计方法和来自不同中心的测量结果的差异也可能导致合并结果的系统偏差。最近增加的MaS同种异体移植物的使用和随访不足可能会导致低估与MaS相关的死亡率。作为供体MaS和GF之间联系的混杂因素，对供体和受体本身的药物治疗可能会影响全球代谢组。在固定的移植后时间内对移植组织进行的代谢组学分析可能会提供深入的知识，以建立器官代谢物与疾病表型之间的准确联系。出于种族原因，一项基于大鼠肝移植后肝活检的预先设计的代谢组学研究正在进行中。尽管潜在的候选代谢物内部验证趋势稳定，但仍需要进行验证。但是，这项工作仅限于临床LT中收集的样本较少。此外，该结果还需要在外部队列中进一步验证，而新建的扩展队列正在准备中。总之，代谢组学特征可以通过同种异体移植MaS的状态来区分IPF患者。内源性类固醇的生物合成或外源性糖皮质激素的残留都与移植后GF的发生有关。甘油磷脂代谢途径的功能障碍是连接供体MaS和最终GF的链接。PC和PE降低是造成器官衰竭的MaS致命影响的罪魁祸首。结合代谢组学和围手术期临床数据的综合预后模型可能有助于监测LT后的长期GS。这项研究根据组学数据揭示了MaS在GF上的分子致病机理，为机械灌注提供了准确的目标，这可能有助于提高移植物质量并扩大供体库。表3 移植后预后预测模型候选代谢物总结

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32984324/

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