科研 | 成中医&上中医：作为罗通定的潜在靶标，Cyr61可触发宫颈癌细胞的凋亡（国人佳作）

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编译：微科盟李可爱，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

宫颈癌是一种严重威胁人类健康的常见女性恶性肿瘤，本研究探讨了蔓荆子天然产物罗通定(RTF)的抗宫颈癌作用及其潜在机制。研究结果显示，罗通定可通过体外诱导细胞凋亡来抑制宫颈癌细胞系的增殖，随后我们在接种HeLa细胞的异种移植模型上进一步证实了罗通定的抗肿瘤作用。此外，我们的结果还证明了RTF的抗肿瘤作用可能与活性氧通过MAPK和PI3K/Akt信号通路诱导线粒体依赖性凋亡有关。并且我们利用蛋白质组学分析和药物亲和反应靶标稳定性结合质谱(DARTS-MS)，表明Cyr61是宫颈癌细胞中RTF的潜在靶标。我们目前的研究将有助于开发未来宫颈癌治疗的候选药物RTF。

论文ID

原名：The Cyr61 Is a Potential Target for Rotundifuran, a Natural Labdane-Type Diterpene from Vitex trifolia L., to Trigger Apoptosis of Cervical Cancer Cells译名：作为罗通定的潜在靶标，Cyr61可触发宫颈癌细胞的凋亡
期刊：Oxidative Medicine and Cellular Longevity
IF：5.076发表时间：2021.05   通讯作者：张宏，彭伟，栾鑫
通讯作者单位：成都中医药大学，上海中医药大学

实验设计

实验结果

1.RTF抑制宫颈癌细胞的增殖
通过诱导细胞凋亡制备了足够的细胞毒性因子单体后，我们使用CCK-8分析进一步评估了RTF对宫颈癌细胞系HeLa和SiHa细胞的细胞毒性作用。图1(a)中显示的结果表明，在24小时(8.67μm和7.29μM)和48小时(6.15 μm和5.49μM)处理中，实时荧光显示RTF具有显著的抗HeLa和SiHa细胞增殖活性，IC₅₀值均小于10μM。DAPI，一种脱氧核糖核酸特异性荧光染料，通常用于观察细胞的核形态。如图1(b)所示，在HeLa和SiHa的正常癌细胞系中，细胞核是圆形且完整的，具有微弱的荧光，而RTF处理可以在宫颈癌细胞中诱导特征性的凋亡特征，例如核浓缩、亮度增加和细胞数量减少。进一步的流式细胞术分析表明，在G2/M期，实时荧光诱导细胞周期停滞(图1(c))。以前的文献已经证实G2/M期阻滞可以诱导细胞凋亡，为了进一步证实RTF是否能诱导细胞凋亡，我们还通过流式细胞术分析进行了FITC结合膜联蛋白V/PI染色，这是一种被广泛认可的细胞凋亡检测方法，结果也表明RTF能诱导HeLa和SiHa细胞凋亡(图1(d))。图1 RTF通过诱导细胞凋亡抑制宫颈癌细胞系HeLa和SiHa的增殖
(a，b)RTF对宫颈癌细胞株HeLa和SiHa的细胞毒活性。细胞用重组人表皮生长因子处理24或48小时，然后用CCK-8法检测细胞增殖抑制率(%)，并计算重组人表皮生长因子对HeLa和SiHa细胞的IC50值。(2)通过DAPI染色进行凋亡检测。细胞经实时荧光处理24小时后，用DAPI染色法检测凋亡细胞并在荧光显微镜下观察。(c，d)通过流式细胞术检测细胞周期停滞和凋亡。细胞经实时荧光处理24小时，凋亡细胞分别用磷脂酰肌醇和膜联蛋白V-FITC/磷脂酰肌醇染色后进行流式细胞术分析。数据表示为平均标准差，星号表示显著差异。 2.RTF可增加宫颈癌细胞的活性氧水平，降低基质金属蛋白酶
活性氧是线粒体依赖性细胞凋亡的关键调节因子。如图2(a)和2(c)所示，在荧光显微镜和流式细胞仪下，我们用DCFHDA荧光探针测定HeLa和SiHa细胞内活性氧水平时，实时荧光处理能显著提高细胞内活性氧水平。此外，图2(b)所示，类似于H₂O₂(20μM)的阳性对照，实时荧光可以显著降低HeLa和SiHa细胞的基质金属蛋白酶。所有以上结果表明RTF可以通过调节线粒体功能诱导宫颈癌细胞凋亡。图2 RTF 诱导宫颈癌细胞中 ROS 水平升高和 MMP 降低
(a, c) HeLa 和 SiHa 细胞的 ROS 水平测定。细胞用RTF处理24小时，然后用DCFH-DA荧光探针染色并在荧光显微镜（×200）和流式细胞术下观察ROS水平。(b) HeLa 和 SiHa 细胞的 MMP 测定。细胞用RTF处理24 h，然后用JC-1荧光探针染色并在荧光显微镜（×200）下观察ROS水平；H₂O₂(20μM)用作阳性对照。
3.实时荧光显示RFT抑制体内肿瘤生长
以上结果表明RTF对宫颈癌细胞有抗肿瘤作用。为了证实RTF在体内的抗肿瘤作用，我们随后进行裸鼠异种移植模型。如图3(a)和3(c)所示，与阳性对照组(顺铂，3毫克/千克/3天)相似，与对照组相比，实时荧光(40毫克/千克)显示在体内对HeLa异种移植瘤具有明显的抗肿瘤作用。然而，小鼠的RTF处理没有毒性（图 3（b））。此外，进一步的TUNEL结果(图3(d))还表明，肿瘤转移因子能显著诱导肿瘤组织中的细胞凋亡。图3 RTF抑制体内肿瘤生长
(a)异种移植小鼠肿瘤生长曲线；(b)小鼠体重变化；(c)异种移植小鼠的肿瘤重量；肿瘤组织的TUNEL分析。数据表示为平均标准差(n =5)，星号表示显著差异，p <0:05和p <0:01，与对照组相比。 4.RTF诱导宫颈癌细胞线粒体依赖性凋亡
线粒体依赖性凋亡是细胞死亡的最重要途径之一，caspase和Bcl-2家族中的蛋白质是这种凋亡途径中的主要调节因子。我们目前的研究结果(图4(a))显示，与对照细胞相比，RTF处理(8和16μM)可以在统计学上上调裂解的半胱天冬酶家族蛋白(裂解的半胱天冬酶-3、裂解的半胱天冬酶-8和裂解的半胱天冬酶-9)和促凋亡Bcl-2家族蛋白(Bax和Bim)，同时在统计学上下调抗凋亡Bcl-2家族蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)。此外，Apaf-1和PARP也是诱导细胞凋亡的两种重要蛋白，结果表明，与对照组细胞相比，RTF处理(8和16μM)可增加HeLa细胞中这两种蛋白的表达。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K/Akt信号是细胞凋亡的两种重要的上游信号通路，我们目前在图4(b)和4(c)中显示的结果表明，RTF处理(8和16μM)可以在统计学上下调HeLa细胞中PI3K、Akt和ERK的磷酸化，而上调JNK的磷酸化。此外，半胱天冬酶-3的激活依赖于细胞色素c的释放，因此，下一步，激光共聚焦显微镜被用于双重检查细胞色素c在线粒体依赖性凋亡过程中的释放，有丝分裂跟踪器用于定位细胞色素c在这一过程中的存在。如图4(d)所示，RTF治疗可导致胱天蛋白酶-3的激活以及细胞色素c的释放。图4 RTF诱导的宫颈癌细胞线粒体依赖性凋亡
（a）实时荧光对半胱天冬酶和Bcl-2家族蛋白的影响；（b）RTF对PI3K/Akt信号蛋白的影响；（c）RTF对MAPK信号蛋白的影响。将细胞用RTF处理24小时，提取总蛋白并用各自的抗体进行蛋白质印迹分析;(d)Cyt c释放的免疫荧光共定位。有丝分裂跟踪器用于定位细胞色素c的存在。未经实时荧光处理的细胞用作对照。数据表示为平均标准差(n =3)，星号表示显著差异，p < 0:05和p < 0:01，与对照组相比。 5.Cyr61是RTF触发宫颈癌细胞凋亡的潜在靶点
RTF可通过诱导线粒体依赖性凋亡而引发宫颈癌细胞凋亡；然而，RTF的具体潜在药物靶点仍不清楚。因此，我们开展了无标记定量蛋白质组学分析和药物亲和响应靶稳定性组合质谱分析，以探索潜在的药物靶点。相关结果表明，与对照组相比，CCAR1和Cyr61是RTF的两个潜在药物靶点，相对表达为0.525和2.963。此外，我们进一步在癌症基因组图谱(TCGA)数据库中筛选这两种蛋白质，发现TCGA分析结果(图5(a))与我们的质谱和蛋白质组学结果一致。此外，我们测定了这两种蛋白在HeLa细胞中的表达；结果表明，在HeLa细胞中，重组逆转录病毒处理组能显著上调Cyr61的表达，而对照组和重组逆转录病毒处理组之间的CCAR1表达无明显差异(图5(b))。图5 RTF上调HeLa细胞Cyr61的表达
（a）宫颈癌中CCAR1和Cyr61的TCGA分析；（b）RTF对HeLa细胞中CCAR1和Cyr61表达的影响。数据以平均标准差表示，星号表示显著差异。 为了进一步证实Cyr61是否是RTF的药物靶点，我们进行了DARTS和CETSA分析。如图6(a)和6(b)所示，结果表明在用RTF后，与对照相比，Cyr61在链霉蛋白酶和热处理下显示出更稳定的性质。此外，我们通过MST分析确定了RTF和Cyr61的结合亲和力，图6(c)中的结果显示结合亲和力的解离常数(Kd)值为3:8 4:5μM，表明Cyr61与RTF具有很强的结合亲和力。此外，我们还分析了Cyr61中RTF的可能结合位点，如图7(d)所示；室温荧光显示RTF与Cyr61的两个氨基酸残基(HID474和ASP 458)相互作用。图6 Cyr61是RTF治疗宫颈癌的药物靶点
DARTS (a)和CETSA (b)分析，细胞暴露于室温下和0.5%二甲基亚砜3 h，提取总蛋白，用链霉蛋白酶和热处理；最后，使用蛋白质印迹分析来分析反应产物。(c) MST测定，将标记的蛋白质样品与系列稀释的实时荧光样品混合，并将混合物装载到标准毛细管中，并用MST仪器扫描。最后，使用纳米分析确定Kd值。（d）分子对接分析，使用Glide 6.9软件模块进行分子对接。
图7 实时荧光素抗肿瘤作用的分子机制
Cyr61是RTF触发宫颈癌细胞凋亡的潜在靶点。

讨论

据我们所知，这是关于RTF在体内和体外对人宫颈癌细胞系的抗肿瘤作用及其可能的分子机制和药物靶点的第一份系统报告。在这项研究中，我们发现重组人表皮生长因子通过诱导线粒体介导的内在凋亡对宫颈癌细胞株显示出显著的抗肿瘤作用。使用生物物理蛋白质组学方法，我们发现Cyr61是RTF触发细胞凋亡的潜在靶点。如今，人们普遍认为，不受控制的细胞增殖和无序的凋亡导致受损细胞积累，是各种形式癌症的主要原因之一。细胞凋亡是已知的生理性细胞自杀的程序性细胞死亡方式，也是癌症治疗的理想策略。目前，基于现代药物发现技术，如生物活性导向提取、高通量筛选、高含量筛选和计算机辅助筛选，研究者从植物或草药中发现了越来越多具有良好抗肿瘤特性的天然单体。在我们目前的研究中，我们报道了天然的二萜类化合物RTF对宫颈癌的抗肿瘤作用。我们对两种已知的宫颈癌细胞系HeLa和SiHa的RTF抗肿瘤活性进行了评价，发现其具有良好的抗肿瘤活性，IC₅₀小于10μM的两种细胞系都具有抗增殖特性。我们进一步的实验还发现，RTF通过诱导细胞凋亡而对宫颈癌细胞产生抗肿瘤作用。因此，我们进一步探索了可能的细胞凋亡途径。重要的是，我们发现RTF也能诱导基质金属蛋白酶的减少和活性氧积累的增加，这证明RTF可能触发线粒体依赖性凋亡。接下来，我们确定了一些与线粒体依赖性凋亡途径相关的关键蛋白表达，包括caspase家族和Bcl-2家族。正如我们所料，RTF治疗可以上调促凋亡蛋白，包括裂解的caspase-3、裂解的caspase-8、裂解的caspase-9、Bax、Bim、Apaf-1和裂解的PARP，同时下调抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)。此外，我们还进行了未标记的定量蛋白质组学分析，以探讨RTF抗肿瘤作用的深层可能机制，基于差异蛋白的相关KEGG分析显示，PI3K/Akt和MAPK信号通路可能与RTF的抗肿瘤作用有关。先前的科学报告表明，PI3K/Akt和MAPK信号通路也与活性氧诱导的线粒体依赖性凋亡密切相关。因此，我们研究了两种信号通路中的相关蛋白，发现实时荧光处理可以下调PI3K、Akt和ERK的磷酸化，而上调HeLa细胞中JNK的磷酸化。综上所述，我们的结果表明RTF的抗肿瘤作用可能与通过调节MAPK和PI3K/Akt信号通路导致的线粒体依赖性凋亡有关。然而，RTF的直接分子靶点仍不清楚。分子靶标鉴定是进一步优化先导化合物分子结构和药物可用性的一项重要而艰巨的工作。因此，我们希望通过一些新的技术，如快速反应堆质谱、化学发光分析，MST和分子对接。基于蛋白质组学分析、DARTS-MS和癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析，Cyr61被筛选为RTF的可能分子靶标。此外，最近出现的两种监测细胞或组织中药物靶标的有效策略DARTS和CETSA分析，也被用来确认Cyr61是否是RTF的药物靶标。我们的结果表明Cyr61在链霉蛋白酶和热处理下表现出更稳定的性质。此外，质谱分析结果表明，Cyr61与RTF有很强的结合亲和力，Kd值为3:8 4:5μM，分子对接表明RTF与Cyr61的2个氨基酸残基(HID474和ASP 458)有相互作用。这些结果表明Cyr61可能是RTF触发宫颈癌细胞凋亡的一个靶点。Cyr61(属于CCN家族，也称为CCN1)是一种分泌型基质细胞蛋白，具有多种功能，可以调节各种重要的细胞活动，有时还具有相反的功能。越来越多的证据表明，Cyr61不仅能促进细胞的增殖和存活，还能引发细胞凋亡、细胞周期停滞和细胞死亡。此外，Cyr61与各种癌症的发展密切相关，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和宫颈癌。据报道，Cyr61的上调可加重乳腺癌的发展和转移；然而，我们还注意到Cyr61在子宫癌、宫颈癌和肺癌中的表达较低。因此，Cyr61可能是子宫内膜癌、宫颈癌和肺癌的抗肿瘤调节剂。重要的是，ROS积累在Cyr61诱导的凋亡中起着至关重要的作用，然后ROS可以进一步调节MAPK和PI3K/Akt信号通路，接着是线粒体依赖性凋亡和DNA损伤反应。图7总结了肿瘤坏死因子抗肿瘤作用的相关潜在分子机制途径。

结论

总之，我们的研究表明，罗通定对宫颈癌有显著的抑制作用，Cyr61可能是这种天然单体诱导宫颈癌细胞凋亡的分子靶点。本研究将有助于RTF作为未来宫颈癌治疗候选药物的开发，也为今后其他天然活性化合物的分子靶标鉴定提供了有效的参考。

原文链接：  

https://www.scienceopen.com/document?vid=595d4825-c262-4d8d-9101-d4c0edae5ef5

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