科研 | EMBO Rep：去泛素酶USP36促进snoRNP基团的SUMO化，是核糖体生物发生所必需的

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导读

SUMO化在调节包括核糖体生物合成在内的多种细胞过程中起着关键作用。蛋白质组学分析和实验证据表明，SUMO修饰了许多参与核糖体生物合成的核仁蛋白。然而，这些蛋白质在细胞中是如何被SUMO化的还不清楚。在这里，我们报告USP36，一种核仁去泛素化酶（DUB），促进核仁SUMO化。USP36的过度表达增强了核仁SUMO化，而其敲除或基因缺失降低了SUMO化的水平。USP36与SUMO2和Ubc9相互作用，在细胞和体外直接介导SUMO化。我们发现USP36在细胞和体外促进小核仁核糖核蛋白（snoRNP）组分Nop58和Nhp2的SUMO化，并促进它们与snoRNAs的结合。它还促进snoRNP组分Nop56和DKC1的SUMO化。在功能上，我们发现USP36的敲除明显损害了rRNA的加工和翻译。因此，USP36促进snoRNP基团SUMO化，对核糖体生物发生和蛋白质翻译至关重要。

论文ID

原名：The deubiquitinase USP36 promotes snoRNP group SUMOylation and is essential for ribosome biogenesis译名：去泛素酶USP36促进snoRNP基团的SUMO化，是核糖体生物发生所必需的
期刊：EMBO Reports
IF：7.497发表时间：2021.06通讯作者：Mu-Shui Dai
通讯作者单位：俄勒冈健康与科学大学

实验设计

实验结果

1. USP36促进细胞内的SUMO化，主要是在核仁中
在我们对USP36的SUMO调节的初步研究中，我们偶然发现USP36显著增加了细胞中蛋白质SUMO化的水平。我们证实USP36的过表达显著促进了H1299（图1A）、HeLa和U2OS（图1B）以及其他受试细胞系如293（图EV1A）和乳腺癌T47D（图EV1B）细胞中的SUMO2/3结合。这种效应对USP36是特异性的，因为过表达JOSD3、另一种核仁DUB（图EV1C）或核DUB USP7（图EV1D）不会增加SUMO化。在这项研究中，我们关注SUMO2，而USP36也促进SUMO1结合（图EV1E和F）。镍（Ni²⁺-NTA珠）纯化方法证明USP36的过度表达通过细胞中外源性His-SUMO2显著增强SUMO化（图EV1G）。为了检测内源性USP36是否也能调节细胞内蛋白SUMO化水平，我们进行了基因敲除实验。如图1C所示，两个单独的shRNA敲除USP36可显著降低H1299细胞中SUMO化物种的水平；同样，USP36的敲除也降低了HeLa（图1D）和U2OS（图1E）细胞中SUMO化物种的水平。因此，内源性USP36也促进SUMO化，这种作用不是细胞类型特异性的。USP36主要定位于核仁（图1）。为了确定USP36是否促进核仁中的SUMO化，我们进行了细胞分离分析。如图1F所示，USP36显著增加了H1299细胞核仁中的蛋白SUMO化，但没有增加核浆中的蛋白SUMO化。我们在HeLa细胞中也观察到类似的结果（图EV1I），因此，USP36主要促进核仁蛋白质的SUMO化。图1 USP36促进细胞内的SUMO化
A、B，过表达USP36促进细胞内的SUMO化。用IB检测H1299 (A)、U2OS和HeLa (B)细胞的全细胞裂解液(WCL)，转染对照空载体或Flag-USP36。C-E，H1299 (C)， HeLa (D)和U2OS (E)细胞感染空载(scr)或USP36 shRNA慢病毒，通过IB检测。F，用对照或V5-USP36转染的H1299细胞分为细胞质(Cyto)、核质(Np)和核仁(No)部分，用IB检测。 2. USP36 N端是促进SUMO化所必需的
为了了解USP36如何调节SUMO化，我们研究了USP36是否控制SUMO途径酶的水平，因为USP36是一个DUB 。然而，USP36并没有增加SUMO E1（SAE1和SAE2）或SUMO E2（Ubc9；图EV2A），也没有降低核SUMO蛋白酶SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7和USPL1的水平（图EV2B和C），表明USP36不通过控制SUMO途径酶的水平促进SUMO化。这些结果促使我们测试USP36是否直接促进SUMO化。然后我们检查了USP36的哪个区域参与促进SUMO化，我们用USP36的不同片段转染细胞，发现含有N端USP结构域的区域（氨基酸1420），而不是中间和C端区域，对于SUMO2/3促进SUMO化是必需的（图2A），这表明该N端区域可能具有SUMO E3活性（图2B）。由于这个N-末端区域同时包含DUB活性和促进SUMO化的活性，我们接下来询问SUMO促进活性是否与DUB活性相关。为此，我们研究了无催化活性的USP36突变体（图2B和EV2D）对SUMO化的影响。有趣的是，我们将DUB催化的Cys 131突变为Ala (C131A)也会抑制USP36的活性，从而促进内源性SUMO（图2C）或外源表达SUMO2（图2D）的SUMO修饰，而DUB催化的质子受体His 382突变为Ala（H382A）促进SUMO化的效率与野生型（WT）USP36相同（图2C和D）。Ni²⁺-NTA下拉实验进一步证实，H382A而不是C131A突变体增强了细胞中His-SUMO2的SUMO化（图2E）。此外，用纯化的核仁检测SUMO化也证实了H382A而不是C131A突变体促进核仁蛋白质的SUMO化（图EV2E）。因此，USP36的SUMO化促进活动并不依赖于它的DUB活动。这些结果还表明，C131可能在结构上对USP36的正确构象起重要作用，从而介导SUMO化反应。 图2 USP36 N端是促进SUMO化所必需的
A，H1299细胞转染Flag-USP36或指定的缺失突变体，然后进行IB分析。B，USP36的示意图，表明USP36的N末端包含USP催化结构域，是其SUMO E3活性所必需的。催化残基C131和H382如图所示。C，转染WT-USP36、C131A或H382A突变体的H1299细胞通过IB检测SUMO化蛋白。D，转染WT-USP36或指定突变体和V5-SUMO2的H1299细胞用抗V5抗体检测总蛋白SUMO化。E，转染WT-USP36或所示突变体和His-SUMO2的H1299细胞经Ni²⁺-NTA琼脂糖珠下拉（PD）后用抗SUMO2/3抗体进行IB。 3. 在体外，USP36与SUMO和Ubc9结合并介导SUMO修饰
接下来，我们检查USP36是否确实具有SUMO连接酶活性。SUMO连接酶与Ubc9和底物结合，以促进SUMO向底物的转移，并与SUMO结合。因此，我们首先检查USP36是否与Ubc9和SUMO结合。事实上，我们通过免疫共沉淀（IP）测定，USP36与细胞中的Ubc9相互作用（图3A）。将重组Ubc9与GST融合USP36蛋白孵育而进行的谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉试验表明，USP36在体外直接与Ubc9相互作用（图3B）。USP36的N末端（aa 1 420），而不是中间和C-末端区域，也足以与Ubc9结合（图3B和EV2F）。为了测试USP36是否与SUMO相互作用，我们进行了co-IP分析。如图3C所示，Flag-USP36与细胞中的SUMO2/3结合蛋白结合。此外，GST-USP36（而不是单独的GST）在体外直接与SUMO2相互作用，优先于聚合SUMO2链（图3D）。同样，在体外（图3D）和细胞内（图2g），N末端（aa 1-420）而不是中间和C-末端区域与SUMO2链结合。这些结果表明USP36通过其N末端与Ubc9和SUMO2相互作用。接下来，我们使用参与细胞周期进程的SUMO靶点PARP1在体外测试USP36是否直接促进SUMO化。如图3E所示，使用重组E1（SAE1/SAE2）、E2（Ubc9）、SUMO2和ATP的体外SUMO化反应导致PARP1的边缘SUMO结合（通道2），这与SUMO E1和E2可在体外介导SUMO化的概念一致，尽管效率较低。值得注意的是，USP36在体外显著增加PARP1 SUMO化（与通道3到通道2相比，图3E）。这些结果表明USP36可能具有一种新的SUMO E3活性。许多SUMO E3，如PIAS1和ZNF451家庭成员需要与Ubc9进行SUMO互动才能具有SUMO E3活性，我们测试了这种互动是否也能在USP36的SUMO E3中发挥作用。如图EV2H所示，将Ubc9的Phe突变为Ala（Ubc9F22A），这削弱了SUMO与Ubc9的相互作用，或将SUMO2的Asp突变为Arg（SUMO2D63R），这会破坏SUMO与Ubc9的相互作用，显著抑制USP36的活性以促进PARP1 SUMO化。这些结果表明，尽管USP36直接与Ubc9或F22A突变体相互作用（图EV2I），但其促进SUMO化的全部活性需要SUMO-Ubc9相互作用，进一步表明USP36作为SUMO E3发挥作用。 图3 在体外，USP36与Ubc9和SUMO相互作用并介导SUMO修饰
A，USP36在细胞中与Ubc9相互作用。将所述质粒转染的H1299细胞与抗Flag抗体共IP，然后在体外进行IB。B，USP36与Ubc9相互作用。纯化的His-Ubc9与GST、GST-USP361800或GST-USP361420一起培养。IB法检测结合蛋白，考马斯染色显示GST和GST融合蛋白。C，USP36在细胞中与SUMO相互作用。转染对照或Flag-USP361800的H1299细胞用抗Flag的共IP进行检测，然后用抗SUMO2/3抗体进行IB检测。D，USP36在体外与SUMO2链相互作用。重组SUMO2链与GST或指示的GST-USP36片段一起孵育。结合蛋白用抗SUMO2/3抗体IB测定。重组蛋白考马斯染色见下图。E，USP36 SUMO化 PARP1的体外试验。重组T7-PARP1蛋白（0.1 μM）与SUMO E1（30 nM）、Ubc9（50 nM）、SUMO2（4 μM）在USP361800（50 nM）和/或ATP（2.5 mM）存在下在30 C下培养5 h，然后通过IB测定。 4. USP36促进细胞中Nop58和Nhp2的SUMO化
为了鉴定USP36增加SUMO化的蛋白质，我们进行了蛋白质组学分析。用Ni²⁺-NTA珠纯化法从转染His-SUMO2和对照质粒或USP36质粒的细胞中纯化SUMO化蛋白，然后进行质谱分析。在包括USP36本身在内的SUMO化蛋白质中，我们发现在USP36转染的样品中，Nop58的指定MS2光谱的数量和参与核糖体生物发生的核仁蛋白质的数量增加（图EV3A）。Nop58和Nhp2分别是box C/D和box H/ACA snoRNP复合物的组分，先前被证明是SUMO底物，然而介导这种SUMO化的SUMO E3尚未报道。因此，我们测试USP36是否促进Nop58和Nhp2的SUMO化。事实上，使用Ni²⁺-NTA下拉的体内SUMO化分析表明USP36显著促进外源性Nop58（图EV3B）和Nhp2（图EV3D）以及内源性Nop58（图4A）和Nhp2（图4B）的SUMO化。细胞分离分析显示USP36显著促进了核仁中Nop58和Nhp2的SUMO化（图4C），这与其在核仁SUMO化中的作用一致。我们还证实了先前报道的Nop58中的两个Lys残基K467和K487以及Nhp2中的单个Lys 5（K5）是SUMO化位点。在Nop58（Nop58^2KR）（图EV3C）中K467和K487到Arg的突变和在Nhp2（Nhp2^K5R）（图EV3E）中K5到R的突变消除了它们在细胞中的SUMO化。因此，Nop58和Nhp2都是USP36的内源性SUMO底物。值得注意的是，USP36没有增加核仁蛋白NOLC1（图EV3F）的SUMO化，这是一种先前确定的SUMO底物，表明并非所有核仁蛋白都是USP36的SUMO靶点。一致地，USP36的敲除显著降低了细胞中SUMO化Nop58（图4D）和Nhp2（图4E）的水平。 5. 在体外，USP36 SUMO化Nop58和Nhp2
为了确定USP36是否在体外直接SUMO化Nop58和Nhp2，我们从细菌中表达并纯化了重组GST-Nop58和GST-Nhp2，用于体外SUMO化分析。如图4F所示，含有重组E1、E2、SUMO2和ATP的体外SUMO化反应导致Nhp2的边缘SUMO结合。添加重组USP36在体外以剂量依赖性（图4F）和时间依赖性（图4G）的方式显著促进Nhp2 SUMO化。类似地，USP36在体外也促进Nop58 SUMO化（图4H）。因此，USP36 SUMO化在体外同时抑制Nop58和Nhp2。 图4 在细胞和体外，USP36 SUMO化Nop58和Nhp2
A、B，转染His-SUMO2和/或USP36的H1299细胞经Ni²⁺-NTA琼脂糖珠下拉（PD）和IB检测Nop58（A）和Nhp2（B）的SUMO化。C，USP36促进核仁中的Nop58和Nhp2 SUMO化。从转染His-SUMO2和/或USP36的HeLa细胞中分离的核仁经Ni²⁺-NTAPD处理，然后进行IB。D、E，敲除USP36降低细胞中Nop58和Nhp2 SUMO化。用IB法检测感染scr或USP36 shRNA慢病毒的细胞，显示SUMO化Nop58（D）和Nhp2（E）。F-H，USP36 SUMO化Nhp2和Nop58体外试验。体外SUMO化试验通过在不存在或存在USP36^1-800（50 nM，1；100 nM，2）和/或ATP（2.5 mM），在30℃下持续2 h或指定时间，分别用抗Nhp2和抗Nop58抗体进行IB分析。 6. USP36促进snoRNP蛋白基团的SUMO化
新的证据表明SUMO化倾向于针对一组功能上和物理上连接的蛋白质，称为蛋白质组SUMO化，它允许多种SUMO相互作用基序（SUMO-SIM）相互作用，有助于多蛋白质复合物的形成和稳定。因此，我们研究了USP36是否促进snoRNP蛋白组SUMO化。snoRNP主要有两类，Box C/D snoRNPs包含Box C/D snoRNAs和四个核心蛋白Nop58、Nop56、Nhp2L1和纤维蛋白（FBL，一种甲基转移酶）并介导rRNA 20-O-核糖甲基化，而Box H/ACA snoRNPs包含Box H/ACA snoRNAs和四个其他核心蛋白Nhp2、Nop10、Gar1和DKC1（一种假尿苷合酶）并介导rRNA假尿苷化。这些snoRNPs组装在Cajal小体的核质中并转移到核仁中，在那里它们与前rRNA结合并介导对rRNA加工至关重要的rRNA修饰。我们检测了所有这些snoRNP蛋白的SUMO化，发现Nop56和DKC1，而不是FBL、Nhp2L1、Gar1和Nop10，在细胞中也与SUMO1和SUMO2 SUMO化（图4A-H）；此外，USP36还显著促进Nop56（图5A）和DKC1（图5B）的SUMO化。因此，USP36促进snoRNP组SUMO化。 7. USP36与snoRNPs相互作用
为了检测USP36是否与snoRNP蛋白相关，我们进行了co-IP分析。如图5C和D所示，所有内源性box C/D和box H/ACA snoRNP蛋白与Flag-USP36免疫共沉淀。免疫荧光（IF）染色显示USP36与Nop58和Nhp2在核仁中共定位（图EV3G和H）。USP36与核仁中snoRNP蛋白的相互作用也通过使用纯化核仁的裂解物的co-IP分析得到证实（图5E）。这些数据表明USP36与snoRNP结合并促进snoRNP蛋白SUMO化。 8. USP36不影响snoRNP蛋白的水平
为了了解USP36可能如何影响snoRNP功能，我们首先研究了USP36是否调节这些snoRNP蛋白质的水平，因为USP36是一种DUB，并且SUMO化与蛋白质泛素化相互作用。我们检测了这些snoRNP蛋白的半衰期，发现所有这些snoRNP蛋白都是稳定的蛋白（图5F）。USP36的过表达（图5C和D）或敲除（图5G）均未显著改变内源性snoRNP蛋白的水平。一致地，Nop58和Nhp2泛素化的稳态水平低于可检测水平（图EV4I），这表明USP36主要作用于促进snoRNP蛋白SUMO化。 图5 USP36与snoRNP相互作用，促进snoRNP蛋白SUMO化
A、B ，USP36促进DKC1和Nop56的SUMO化。用所示质粒转染H1299细胞后，分别用Ni²⁺-NTA-PD和IB检测SUMO化Nop56和DKC1。蛋白表达显示在每个面板的底部。C、D，USP36与box C/D（C）和H/ACA（D）snoRNP复合物相互作用。转染空载体或Flag-USP36质粒的H1299细胞用抗Flag抗体IP检测，IB检测所指示的蛋白。E，USP36与核仁中的snoRNP蛋白相互作用。将转染空载体或Flag-USP36质粒的H1299细胞纯化的核仁与抗Flag抗体共孵育，IB检测所指示的蛋白。F，半衰期分析。用IB法测定H1299细胞经50 μg/ml放线菌酮（CHX）处理一定时间后的WCL中snoRNP蛋白的含量。G，USP36不改变内源性snoRNP蛋白的水平，用IB法检测USP36 shRNA慢病毒的HeLa细胞。 9. USP36促进Nhp2和Nop58与snoRNAs的结合
先前已经证明，Nop58的SUMO化对于与snoRNAs的高亲和力结合至关重要。因此，我们接下来用RNA-IP检测USP36介导的SUMO化是否促进Nop58和Nhp2与snoRNAs的结合。如图6A和B所示，USP36的过表达显著促进Nop58与snoRNAs的box C/D类（包括U3、U13、U15b和U22）的结合，但不促进对照U6的结合。类似地，USP36也显著促进Nhp2与snoRNAs的box H/ACA类的结合，包括SNORA10、SNORA24、SNORA66、SNORA75和U64，但不包括U6（图6C和D），暗示USP36介导的SUMO化在snoRNP与snoRNAs结合的调控中起重要作用，从而在rRNA加工和核糖体生物合成中发挥snoRNP功能。 图6 USP36促进Nop58和Nhp2与snoRNAs的结合
A、B，USP36促进Nop58与snoRNAs box C/D的结合。分别或联合转染Flag-Nop58和V5-USP36的H1299细胞用抗Flag或对照小鼠IgG进行RNA-IP检测，然后用RT-qPCR检测所示框C/D snoRNAs（A）。Nop58和USP36蛋白的表达如（B）所示。C、D，USP36促进Nhp2与snoRNAs的结合。分别或联合转染Flag-Nhp2和V5-USP36的H1299细胞用RNA-IP和抗Flag或对照小鼠IgG进行检测，然后用RT-qPCR检测所示的snoRNAs box H/ACA（C），Nhp2和USP36蛋白的表达如（D）所示。 10. USP36对rRNA加工、翻译和细胞生长至关重要
USP36与rRNA的加工有关，但在这一功能中的具体作用尚未得到充分研究。如图7A所示，Pre-rRNA通过主要和次要途径加工成成熟的rRNA。我们使用Northern杂交技术检测USP36在50个外转录间隔区（ETS）、内转录间隔区1（ITS1）和ITS2（图7A）特异性杂交区域的探针，以检测不同加工的rRNA物种，研究USP36在rRNA加工中的作用。如图7B所示，siRNA或shRNA慢病毒对USP36的敲除减弱了rRNA加工的多个步骤，导致47S的大量积累以及21S和12S rRNA前体的减少。一致地，敲除USP36显著抑制细胞中的蛋白质翻译，如Click-iT OPP蛋白质合成测定所确定的（图7C和D）。因此，USP36对于核糖体生物发生和蛋白质翻译是必不可少的。为了进一步测试USP36在SUMO化、翻译和细胞生长中的作用，我们制备了永生化USP36^+/+；Cre-ER和USP36^lox/lox；小鼠胚胎成纤维细胞。USP36^lox/lox的治疗；含4-羟基三苯氧胺（4-OHT）的Cre-ER MEF细胞降低蛋白质SUMO化（图EV5A），显著抑制蛋白质翻译（图EV5B和C）和细胞增殖（图EV5D和E）。慢病毒介导的WT人USP36表达可明显挽救小鼠USP36缺失后蛋白质翻译的抑制，但其DUB催化活性C131A或H382A突变体则不能（图EV5C和E）。分别用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫印迹证实小鼠内源性USP36的有效缺失和人USP36的外源性表达。由于H382A突变体保留SUMO促进活性，我们的结果表明，USP36s对H382A突变体SUMO促进活性的作用可能被其DUB活性在翻译和细胞生长中的重要作用所掩盖。 图7 USP36对于rRNA的处理和翻译至关重要
A，rRNA前处理图，显示rRNA前处理中间产物和Northern杂交分析中使用的探针（50-ETS、ITS1和ITS2）的位置（左）以及主要（黑色）和次要（灰色）处理途径（右）。B，rRNA处理需要USP36。如图所示，通过Northern blot使用50-ETS、ITS1和ITS2探针检测转染scr或USP36 siRNA（左图）或感染scr或USP36 shRNA慢病毒（右图）的HeLa细胞的rRNA处理。C、D，敲低USP36可以抑制翻译。将感染scr或USP36 shRNA慢病毒的HeLa细胞与O-炔丙基嘌呤霉素（OPP）孵育，然后进行Click-iT-OPP蛋白合成测定。代表性图像（C）和来自三个独立实验的量化（D）。

讨论

USP36是泛素特异性蛋白酶家族的一员，从泛素化底物中去除泛素。到目前为止，USP36的主要功能归因于其在核糖体生物发生中的核仁作用，其作用是通过去泛素化和稳定对核糖体生物发生至关重要的几种蛋白质，包括NPM、DHX33和酵母RNA Pol I亚单位Rpa190（人类RPA194）以及c-Myc，核糖体生物发生的主要调节者。此外，USP36已被证明可通过使线粒体蛋白SOD2去泛素化，调节自噬，并在氧化应激反应中发挥作用。与许多核仁蛋白质一样，对核糖体生物发生至关重要，USP36基因敲除对小鼠胚胎具有致死性，去除各种细胞系中USP36的表达会损害细胞生长和增殖。然而，USP36在核糖体生物发生和细胞生长中重要作用的详细机制尚不清楚。我们的发现表明USP36促进snoRNP蛋白SUMO化从而揭示了其在核糖体生物发生中的作用的新机制。核糖体生物发生相关蛋白是细胞中功能上相互连接的SUMO靶点的主要群组之一，SUMO化在核仁核糖体生物发生中起关键作用。然而，这些蛋白质在核仁中是如何被SUMO化的还有待了解。在这项研究中，我们发现USP36与snoRNPs box C/D及box H/ACA结合，并促进每个复合物中两种蛋白质的SUMO化（分别为Nop58和Nop56、Nhp2和DKC1），证明USP36促进snoRNP SUMO化。我们的结果支持最近出现的观点，即SUMO化倾向于修饰功能蛋白复合物中的多种蛋白质，如DNA损伤修复蛋白，端粒和核糖体生物发生相关蛋白。有趣的是，snoRNPs是非常稳定的，USP36的过表达和敲除都不会显著影响细胞中snoRNP蛋白的水平。一直以来，内源性Nop58和Nhp2不经历显著的泛素化（图EV4I），因此，USP36主要功能是介导Nop58和Nhp2 SUMO化以调节它们的活性，而不是水平。在正常情况下，USP36可能主要作用于SUMO化核仁蛋白并调节其功能，而其DUB活性可能在维持这些组装在多蛋白复合物中的蛋白质在核仁中的SUMO化状态中发挥作用。Nop58的SUMO化已被证明是其与snoRNAs结合所必需的。一致地，我们证明USP36增强了Nop58和Nhp2与各自的snoRNAs的结合。因此，USP36可能是通过促进snoRNP基团SUMO化来实现与核仁中snoRNAs的高亲和力结合所必需的，因此对于snoRNP生物发生、rRNA修饰和rRNA加工至关重要。实际上，USP36的敲除明显损害了rRNA加工和蛋白质翻译的多个步骤（图7）。在机制上，我们发现USP36可能具有一种新的SUMO连接酶活性。SUMO连接酶作为支架，促进SUMO从带电的Ubc9转移到需要结合到Ubc9（E2）、SUMO和底物的底物。我们发现USP36同时与Ubc9（E2）及其底物Nop58和Nhp2结合。在细胞和体外，它也与SUMO2相互作用。重要的是，USP36使用重组蛋白在体外直接促进多种底物的SUMO化，包括Nop58、Nhp2和PARP1（图3E和4F-H）。因此，我们的数据表明USP36像一个SUMO连接酶一样介导核仁蛋白SUMO化，生化和结构分析揭示了真正SUMO E3三个家族的作用机制。SP-RING家族SUMO E3利用类似泛素E3环结构域的SP-RING结构域和包含SIM样基序的相邻SP C末端结构域（SP-CTD）。RanBP2 SUMO E3活动被映射到一个内部重复序列（IR）1-M-IR2区域，而ZNF451家族E3利用其N端串联SIM区域，称为SIM1-M-SIM2基序。这些SUMO E3结构域介导与SUMO和Ubc9的相互作用，促进SUMO从SUMO带电的Ubc9向底物转移。值得注意的是，虽然RanBP2直接与Ubc9的相互作用，但许多SUMO E3，如PIAS1和ZNF451家庭成员需要SUMO-Ubc9相互作用而具有SUMO E3活性。我们发现USP36的完全SUMO促进活性也需要SUMO-Ubc9相互作用，因为SUMO2D63R或Ubc9F22A突变体对相互作用的破坏抑制了USP36促进SUMO化的活性，进一步说明USP36可以作为SUMO E3，尽管USP36仍有可能作为一种辅助因子增强SUMO化。有趣的是，DUB活性和SUMO活性都位于USP36的N端区域。然而，SUMO促进活性独立于其DUB活性，因为缺乏DUB功能的H382A突变体保留SUMO促进活性（图2）。因此，我们可以通过这种单点突变来区分这两种活性。由于DUB催化残基C131的突变也消除了USP36的SUMO促进活性，C131可能是SUMO E3在结构上所必需的。未来的结构研究将阐明USP36是否为真正的SUMO E3，其DUB和SUMO E3活性之间潜在转换的机制，并有助于找到USP36突变体，特异性地使SUMO E3失活，而不是DUB失活。这些突变体对于阐明SUMO E3在核糖体生物发生和细胞生长中的特定功能至关重要，因为USP36H382A未能通过内源性USP36的缺失挽救蛋白质翻译和细胞生长的抑制（图EV5）。随着USP36增加核仁SUMO化的总水平（图1E和EV1I），可以想象USP36可能促进与核糖体生物发生相关的其他核仁蛋白质的SUMO化，并作为核仁SUMO化的中央调节中枢来调节核糖体生物发生和翻译。进一步的蛋白质组学分析是有必要的，以确定额外的USP36 SUMO化目标在核仁。由于核糖体生物发生的过度活化与人类癌症密切相关，而USP36本身在各种人类癌症中过表达，因此USP36可能是人类癌症中一个很有前途的治疗靶点。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33852194/

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