科研 | Stem Cell Res Ther.：来自人脐带间充质干细胞的外泌体可以减轻激素抵抗型哮喘的炎症（国人佳作）

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

重度激素抵抗型哮喘(SSRA)是在哮喘治疗的一个严重临床问题，受影响的患者有严重的临床症状，生活质量恶化，并且对类固醇无反应，因此，迫切需要有效的治疗。由间充质干细胞(MSC-Exo)衍生的外泌体通过其免疫调节作用成为治疗肺部炎症疾病的有效方法。在本研究中，我们探讨了MSC-Exo对SSRA的治疗作用，并明确了MSC-Exo的治疗机制。我们成功分离并鉴定了hUCMSCs的外泌体，也验证MSC-Exo气管内给药逆转了SSRA小鼠的AHR、组织病理学改变和炎症反应。巨噬细胞的系统性耗竭减弱了MSC - Exo的治疗作用。我们发现MSC-Exo处理抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞M1极化，促进M2极化。随后从TMT标记的定量蛋白质组学分析中确定肿瘤坏死因子受体相关因子1 ( TRAF1 )为可能与调控巨噬细胞极化密切相关的中心蛋白。TRAF1的敲除和过表达表明MSC-Exo处理对巨噬细胞极化、NF-κB和PI3K / AKT信号的影响依赖于TRAF1。结果表明，MSC-Exo可通过抑制TRAF1重塑巨噬细胞极化，从而减轻炎症反应改善SSRA程度。

论文ID

原名：Exosomes from human umbilical cord mesenchymal stem cells attenuate the inflammation of severe steroid-resistant asthma by reshaping macrophage polarization译名：人脐带间充质干细胞的外泌体通过重塑巨噬细胞的极化减轻重度激素抵抗型哮喘的炎症
期刊：Stem Cell Research & Therapy
IF：5.116发表时间：2021.03通讯作者：王放
通讯作者单位：吉林大学

实验设计

实验结果

1. 表征hUCMSC-Exo
我们提取hUCMSC - Exo，通过透射电镜( TEM )分析表明hUCMSC - Exo具有完整的结构和近球形的形貌(图1a )。纳米颗粒跟踪分析( NTA )显示hUCMSC-Exo的峰直径为127.7 nm (图1b )。流式细胞术分析证实外泌体具有CD63 ( 82.6 % )和CD81 ( 84 % )的阳性代表标记(图1c )。这些结果表明hUCMSC的外泌体被成功提取。图1 hUCMSC-Exo表征
a，透射电镜分析hUCMSCs来源的囊泡(刻度棒= 100 nm ) . b，纳米粒子追踪分析hUCMSCs来源的囊泡. c，采用流式细胞仪检测Exosome代表标记CD63和CD81 2. MSC-Exo抑制OVA/ CFA诱导的小鼠SSRA特征
我们构建了OVA / CFA诱导的SSRA小鼠，并按照如图2a所示的实验方案将外泌体注入支气管。我们首先评估MSC-Exo对肺功能的影响。与对照组相比，OVA / CFA组肺阻力更重，肺动态顺应性更低，DEX未能逆转气道过度反应（AHR）。有趣的是，MSC - Exo治疗降低了肺阻力，逆转了肺动态顺应性(图2b-e )。这一结果表明MSC-Exo治疗可改善OVA / CFA诱导的SSRA中的AHR，支气管肺泡灌洗液中，中性粒细胞浸润在严重哮喘患者或小鼠模型中升高。然后我们评估了BAL液里中性粒细胞(CD11b⁺Ly6G⁺)的浸润情况。我们发现，与OVA/CFA组相比，DEX治疗OVA/CFA组(OVA/CFA+ DEX)中性粒细胞数量没有减少，而MSC-Exo治疗组(OVA/CFA+MSC-Exo)中性粒细胞数量减少(图2f)。此外，肺组织H&E染色也显示OVA / CFA组气道、肺实质和血管中性粒细胞浸润增加，组织学评分更高。OVA / CFA + MSC - Exo组中性粒细胞浸润明显减少，组织学评分降低(图2g )。这些结果表明MSC-Exo在体内能有效减轻SSRA的炎症反应。 图2  MSC-Exo对小鼠OVA/CFA诱导的SSRA的治疗作用
a，小鼠模型构建和MSC-Exo处理的实验流程图。b，不同剂量乙酰甲胆碱对呼吸系统阻力的影响。c，响应于50mg/ml乙酰甲胆碱的呼吸系统阻力的变化。d，不同剂量乙酰甲胆碱对肺动态顺应性的影响。e，响应于50mg/ml乙酰甲胆碱的肺动态顺应性的变化。f，BAL液中嗜中性粒细胞（CD11b⁺Ly6G⁺）的流式细胞术分析。g， H＆E肺组织染色和组织学评分评估。以上：放大倍数，200；以下：放大倍数，400。 3.巨噬细胞减少MSC-Exo对OVA/CFA诱导的小鼠SSRA的影响
由于巨噬细胞在呼吸系统疾病中发挥重要作用，我们接下来通过腹腔注射氯膦酸脂质体来消耗小鼠巨噬细胞。巨噬细胞清除实验按照图3a所示的实验方案进行。氯磷酸酯脂质体有效地消耗了肺、腹膜和脾脏中的巨噬细胞(图3b)。PBS脂质体处理组，MSC-Exo减少AHR和炎症细胞浸润，与上述结果一致。然而，MSC-Exo在OVA/CFA诱导的SSRA小鼠中减少炎症反应的作用在巨噬细胞减少组中不存在，气道阻力和动态顺应性的改善很小(图3c-f)。此外，MSC-Exo对组织病理学的有益作用在巨噬细胞耗竭组也降低(图3g )。总的来说，这些结果说明巨噬细胞是MSC-Exo治疗OVA / CFA诱导的小鼠SSRA所必需的。 图3  MSC-Exo对OVA/CFA诱导的SSRA哮喘小鼠的治疗作用是巨噬细胞依赖性的
a，巨噬细胞耗竭实验的实验示意图。b，来自不同组的肺，腹膜液和脾中巨噬细胞（F4/80⁺CD11b⁺）的流式细胞术分析。c，随着乙酰甲胆碱浓度的增加，呼吸系统阻力的变化。d，响应于50mg/ml乙酰甲胆碱的呼吸系统阻力的变化。e，随着乙酰甲胆碱浓度的增加，肺动态顺应性的变化。f，响应于50mg/ml乙酰甲胆碱的肺动态顺应性的变化。g，H＆E染色和肺组织学评分评估。  4. MSC-Exo改善OVA / CFA诱导的小鼠SSRA炎症反应和调节巨噬细胞极化
巨噬细胞介导的炎症反应和巨噬细胞的极化状态在哮喘的发展和严重程度中起着重要作用。为了进一步评估MSC-Exo对小鼠OVA/CFA诱导SSRA中巨噬细胞的调节作用，我们评估了肺组织上清中炎症细胞因子的产生。OVA/CFA组促炎和M1细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著升高。与OVA / CFA组相比，MSCExo可显著降低上述细胞因子水平(图4a-c，e-g )。相反，与OVA / CFA组相比，MSC-Exo组抗炎细胞因子和M2标记物IL-10水平升高(图4d，h )。为了进一步了解MSC-Exo如何调节OVA / CFA诱导的哮喘小鼠巨噬细胞极化，我们评估了M1标记物iNOS、CD86和M2标记物Arg1和CD206在肺组织中的表达。MSCExo处理后，Arg1和CD206 mRNA水平升高(图4i-l)。与OVA/CFA组相比，MSC-Exo组iNOS蛋白水平下降，Arg1蛋白表达水平升高(图4m)。这些结果表明，MSC-Exo可以抑制OVA/ CFA诱导的SSRA小鼠的炎症反应，并改变肺巨噬细胞的极化。图4 MSC-Exo对OVA/ CFA诱导的小鼠SSRA炎症和巨噬细胞极化的影响
a-d, ELISA检测肺组织上清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和抗炎细胞因子IL-10的蛋白水平。e-h, 通过qRT-PCR检测肺组织中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的mRNA水平。i-l，qRT-PCR检测肺组织中M1标记物iNOS、CD86、M2标记物Arg1和CD206的mRNA水平。m，蛋白印迹检测肺组织iNOS和Arg1定量结果。β-肌动蛋白作为内参。 5. MSC-Exo对LPS刺激的RAW 264.7细胞具有抗炎和极化调节作用
我们发现MSC-Exo治疗改善了OVA / CFA诱导的小鼠SSRA，巨噬细胞是该过程中不可或缺的参与者。在OVA / CFA诱导的SSRA小鼠中，MSC-Exo促进肺M2巨噬细胞极化。为了确定MSC-Exo是否直接影响巨噬细胞表型和细胞因子的产生，我们使用了巨噬细胞极化模型。RAW 264.7细胞经LPS处理12 h后，再MSC-Exo处理24 h。LPS诱导TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS的显著产生，而MSC-Exo显著降低这些促炎因子的水平，增加IL-10和Arg1的表达(图5a-e)。在MS -Exo和LPS刺激的RAW264.7细胞中，M1标志物TNF-α、IL-6、IL-1 β、iNOS、CD86的mRNA水平下调，M2标志物IL-10、Arg1、CD206的mRNA水平上调(图5f，g )。免疫荧光染色也显示M1标记iNOS染色减少，而M2标记Arg1染色在MSC-Exo组较LPS组更明显(图5h )。此外，流式细胞仪分析显示，与LPS组相比，MSC-Exo组iNOS⁺M1巨噬细胞比例下降。与LPS组相比，MSC-Exo组CD206⁺M2巨噬细胞的比例增加（图5i）。这些结果表明MSC-Exo在LPS刺激的RAW 264.7细胞中抑制M1巨噬细胞极化并促进M2巨噬细胞极化。 图5 MSC-Exo对LPS刺激RAW 264.7细胞炎症和巨噬细胞极化的影响
LPS刺激RAW 264.7细胞12 h后，MSC-Exo(10、20、40 μg/ml)作用24 h。a-d 各组RAW 264.7细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的水平。e，不同组RAW 264.7细胞中iNOS和Arg1表达的Western blotting图像和定量。β-肌动蛋白作为内参。f、g， qRT-PCR分析各组RAW 264.6细胞M1标志物TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、CD86和M2标志物IL-10、Arg1和CD206的mRNA水平。h, LPS刺激RAW 264.7细胞12 h后，MSC-Exo (20 μg/ml)作用24 h。i,不同组RAW 264.7细胞中iNOS和CD206的流式细胞术分析的代表性图像。 6. TRAF1参与MSC-Exo介导的巨噬细胞极化
我们的结果表明，无论在SSRA小鼠模型还是在巨噬细胞极化模型中，MSC-Exo均调节巨噬细胞极化。为了更好地了解MSC-Exo处理LPS刺激巨噬细胞后蛋白表达谱的变化，我们利用LPS组和LPS + MSC-Exo组的样本进行TMT标记的定量蛋白质组学研究。我们鉴定了6761个定量蛋白质组，其中84个蛋白质受到明显的调控。聚类分析显示差异表达蛋白，热图显示两组差异明显( LPS组和LPS + MSC-Exo组) (倍数变化> 1.5或< 0.67，p < 0.05 ) (图6a )。火山图显示，在84个差异蛋白中，LPS + MSC-Exo组较LPS组上调21个蛋白，下调63个蛋白( Fold变化> 1.5或< 0.67，p < 0.05 ) (图6b )。在《京都基因与基因组百科全书》( KEGG )信号转导水平的前10位通路分析中(图6c )，包括TNF、NF-κB、PI3K- AKT等信号通路在内的多条通路在巨噬细胞极化方面具有显著特点。通过挖掘富集途径注释的蛋白，我们发现TRAF1多次注释于巨噬细胞极化相关途径，且差异显著。Western blotting证实LPS组TRAF1表达上调，MSCExo处理后表达下调，与蛋白质组学中TRAF1表达水平变化的结果一致(图6d )。为了评估TRAF1在MSC-Exo介导抑制M1极化中的作用，我们利用特异性siRNA人为沉默TRAF1的表达。TRAF1 - siRNA1的敲除效率最高，用于后续实验(图6e )。敲除TRAF1降低iNOS蛋白表达，促进Arg1表达，与MSC-Exo一致(图6f )。此外，我们还进行了TRAF1过表达实验，TRAF1过表达的效率如图6g所示。过表达TRAF1降低MSC - Exo对iNOS和Arg1的影响(图6h )。这些结果表明MSC - Exo对LPS刺激的RAW 264.7细胞的极化调控作用具有TRAF1依赖性。图6 MSC-Exo对巨噬细胞极化的影响与TRAF1有关
用LPS刺激RAW 264.7细胞12小时，然后处理MSC-Exo（20μg/ml）24 h。收集来自LPS组和MSC-Exo组的样品用于蛋白质组学。a，LPS+MSC-Exo组与LPS组比较差异表达蛋白的热图。b，与LPS组相比，LPS+MSC-Exo组显着差异表达蛋白的火山图（垂直虚线，倍数变化>1.5倍；水平虚线，p<0.05；蓝点，TRAF1）。c，KEGG通路富集分析的信号转导前10位。d，通过蛋白质印迹检测TRAF1的表达水平并通过ImagJ定量。β-肌动蛋白用作内部参考。e,用TRAF1 siRNA或NC siRNA转染RAW 264.7细胞。通过蛋白质印迹检测siRNA对TRAF1的敲低效应。β-肌动蛋白用作内部参考。f，使用蛋白质印迹检测iNOS和Arg1的表达水平，并使用ImagJ定量。β-肌动蛋白用作内部参考。g,RAF1过表达转染RAW 264.7细胞。使用蛋白质印迹检测TRAF1的表达水平并通过ImagJ定量。β-肌动蛋白用作内部参考。在TRAF1过表达转染后1小时，用LPS刺激巨噬细胞12小时，然后用MSC-Exo处理24小时。通过蛋白质印迹测量iNOS和Arg1的蛋白质水平，并通过ImageJ软件定量。 7. MSC-Exo通过抑制TRAF1调控NF-κB和PI3K/AKT信号通路的激活
我们已经确定TRAF1在MSC-Exo对巨噬细胞极化的调节作用中的关键作用。为了进一步探讨其机制，我们对蛋白质组学的研究结果进行了分析和挖掘。根据信号转导水平上KEGG通路富集分析，并考虑相关通路与巨噬细胞极化的关系，进一步实验探索NF-κB和PI3K/AKT信号通路。MSC-Exo在LPS刺激的RAW 264.7细胞中显著降低了p65的磷酸化，但增加了PI3K和AKT的磷酸化。这说明MSC-Exo抑制NF-κB信号通路的激活，促进PI3K/AKT通路的激活(图7a)。由于我们发现TRAF1在巨噬细胞极化过程中发挥重要作用，我们使用TRAF1 siRNA进一步探索TRAF1敲低对NF-κB和PI3K/AKT信号通路激活的影响。在LPSs刺激的巨噬细胞中，下调TRAF1可抑制NF-κB信号通路的激活，促进PI3K/AKT通路的激活，表现出与MSC-Exo类似的作用(图7b)。然而，TRAF1的过表达显著降低了MSC-Exo对NF-κB和PI3K/AKT通路的影响(图7c)。综上所示，MSC-Exo对NF-κB和PI3K/AKT信号通路的影响是具有TRAF1依赖性。图7 MSC-Exo通过抑制TRAF1调控NF-κB和PI3K/AKT信号通路的激活
a,用LPS处理RAW 264.7细胞12小时，然后用MSC-Exo处理24小时。通过蛋白质印迹测量p-p65，p65，p-PI3K，PI3K，p-AKT和AKT的蛋白质水平，并通过ImageJ软件定量。b,用siRNA转染后，用LPS刺激巨噬细胞12小时，然后用MSC-Exo处理24小时。通过蛋白质印迹测量p-p65，p65，p-PI3K，PI3K，p-AKT和AKT的蛋白质水平，并通过ImageJ软件定量。c,TRAF1过表达转染后，用LPS刺激巨噬细胞12小时，然后用MSC-Exo处理24小时。通过蛋白质印迹测量p-p65，p65，p-PI3K，PI3K，p-AKT和AKT的蛋白质水平，并通过ImageJ软件定量。 8. MSC-Exo在OVA/ CFA诱导的小鼠SSRA中抑制TRAF1
我们发现MSC-Exo在OVA / CFA诱导的小鼠SSRA中抑制M1巨噬细胞极化，促进M2巨噬细胞极化，并探讨了MSC-Exo通过体外抑制TRAF1调控NF-κB和PI3K / AKT信号通路活化的机制。然后，我们评估了TRAF1蛋白在OVA / CFA诱导的小鼠SSRA中的表达变化及相关通路。我们发现，与对照组相比，OVA / CFA组肺组织TRAF1表达增加。此外，与体外研究一致，MSC-Exo处理抑制OVA / CFA诱导的哮喘小鼠TRAF1的表达。我们还发现MSC-Exo处理较OVA / CFA组p65磷酸化水平明显降低；但MSC-Exo处理较OVA / CFA组仅略微增加PI3K / AKT信号通路的激活(图8a-e )。 图8 MSC-Exo对OVA/ CFA诱导的小鼠SSRA中TRAF1、NF-κB和PI3K/AKT信号通路的影响
a，Western blot检测各组肺组织中TRAF1、pp65、p65、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白水平。b，采用ImageJ软件对所有条带进行定量。显示TRAF1/β-actin、p-p65/p65、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值。

讨论

在这项研究中，我们建立了OVA/CFA诱导的SSRA的小鼠模型。我们发现实验模型出现中性粒细胞浸润和气道高反应性现象，并且地塞米松多对模型组没有作用。所有这些特征与SSRA患者的临床表现一致。我们提出了一种治疗SSRA的新策略，利用外泌体从基于MSC的细胞移植转变为无细胞治疗。我们首次证明了MSC-Exo在SSRA中的治疗效果。然而，MSC-Exo治疗的效果在巨噬细胞耗竭模型中被逆转，这表明巨噬细胞是MSC-Exo的主要下游靶标。我们的工作进一步证实MSCExo有效调节巨噬细胞的极化并减少炎症级联反应，其机制可能是通过靶向TRAF1调控NF-κB和PI3K/AKT信号通路的激活。在SSRA中，持续性和过度炎症反应与控制降低和加重相关。炎症细胞的浸润和促炎细胞因子的积累导致肺部炎症级联反应，加重气道炎症、肺组织损伤和气道重塑。研究结果集中在支持这种炎症加剧的机制和潜在的治疗方法上。更多的研究表明了骨髓间充质干细胞对许多免疫相关疾病的治疗潜力。骨髓间充质干细胞已被证明与所有先天免疫细胞相互作用，并促进抗炎反应。在动物模型和临床前实验研究中，MSC移植对肺炎性疾病具有有益的治疗效果。然而，MSC移植疗法仍存在许多缺点和风险。越来越多的证据表明，MSCs的免疫治疗效果是由细胞间旁分泌信号转导驱动的，外来体是源自母体细胞的纳米级细胞外囊泡。通过细胞内转移生物活性货物如蛋白质、酶、核酸和代谢物，外泌体对这些旁分泌途径发挥直接作用；然而，MSC-Exo在免疫调节中的具体机制尚未详细阐明。在这项研究中，我们研究了来自骨髓间充质干细胞的外泌体在减轻炎症中的作用。外泌体有许多理想的优点，包括无免疫排斥、无致瘤性和无血管阻塞。结果显示MSC-Exo改善了OVA/CFA诱导的SSRA小鼠模型的肺部炎症和气道高反应性。巨噬细胞是肺部炎症的中枢介质，巨噬细胞极化对哮喘的发病机制有着深远的影响。巨噬细胞可极化为M1或M2表型，并参与炎症的发生和消退，这与哮喘的发展密切相关。为了进一步评估巨噬细胞在MSC-Exo治疗中的作用，我们应用了巨噬细胞耗竭模型。值得注意的是，我们发现MSC-Exo的治疗效果在很大程度上取决于与巨噬细胞的相互作用。巨噬细胞极化的过程涉及多种细胞因子、趋化因子、转录因子和免疫调节细胞之间复杂的相互作用。M1巨噬细胞分泌的促炎因子可加重气道高反应性，对中性粒细胞趋化募集起积极调节作用，同时促进中性粒细胞释放炎症因子，放大炎症效应，损伤肺组织。一些研究表明，M1细胞因子在严重哮喘患者中显著增加。此外，M1标记物也在类固醇耐药哮喘患者的肺泡灌洗液中高表达。以上结果暗示M1巨噬细胞在SSRA的发生发展中起着重要作用。然而，与M1巨噬细胞不同，M2巨噬细胞通常具有抗炎功能。M2巨噬细胞分泌的细胞因子IL-10可有效减轻哮喘后气道炎症，促进肺损伤修复，减轻哮喘后气道重塑。因此，M1至M2表型的逆转已被证明是SSRA的潜在治疗策略。本研究证实，无论是SSRA小鼠模型或是LPS刺激的细胞模型，MSC-Exo都能有效地将哮喘中的巨噬细胞从M1表型转化为M2表型。为了进一步研究MSC-Exo通过调节巨噬细胞极化抑制炎症的潜在机制，我们使用巨噬细胞极化模型进行了TMT标记的定量蛋白质组学。发现肿瘤坏死因子受体相关因子1（TRAF1）在MSC-Exo处理的LPS刺激的巨噬细胞中显着下调。TRAF1是参与调节免疫、炎症和细胞凋亡的重要细胞质衔接蛋白。Wan等的研究表明，TRAF1在LPS诱导的急性肺损伤中能够减轻炎症反应，减轻肺损伤。TRAF1是B细胞和T细胞NF-κB活化的关键信号因子，NF-κB的激活促进巨噬细胞向M1极化。我们的研究结果显示，敲低TRAF1使LPS刺激的巨噬细胞NF-κB活化降低，M1极化受到抑制，与MSC-Exo的作用类似。而且，在我们的SSRA模型中，MSC-Exo还抑制TRAF1的表达和NF-κB信号通路的激活，PI3K / AKT信号通路的激活对M2极化至关重要。我们还发现PI3K / AKT信号通路调节巨噬细胞极化，TRAF1的敲除增加了LPS刺激巨噬细胞的PI3K / AKT激活，促进了M2极化，与MSC-Exo的结果相似。然而，与OVA / CFA组相比，MSCExo对OVA / CFA诱导的哮喘小鼠PI3K/AKT活化的影响较小，这种不一致可能是由于巨噬细胞是外泌体的主要靶细胞。在LPS刺激的巨噬细胞中，TRAF1的过表达消除了MSC-Exo对极化、NF-κB和PI3K / AKT信号通路的影响。总之，我们的数据表明TRAF1通过NF-κB和PI3K / AKT信号通路在MSC-Exo介导的巨噬细胞极化中起重要作用。本研究首次探讨MSC-Exo对SSRA的治疗作用。我们着重研究了MSC-Exo对巨噬细胞极化重塑的作用，发现TRAF1是这一过程中的关键角色。本研究为探索SSRA中MSC-Exo的巨噬细胞重塑功能的机制提供了依据。

结论

我们证明MSC-Exo通过巨噬细胞极化重塑改善OVA/CFA诱导的SSRA。MSC-Exo处理通过抑制TRAF1表达，促进巨噬细胞M2极化，调节NF-κB和PI3K/AKT信号通路。本研究为SSRA的治疗提供了一种新的策略。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33761997/

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