科研 | Embo.j :HSP70分子伴侣HSPA1在新生和新合成蛋白质质量控制中的双重作用(国人佳作)
编译:微科盟三金,编辑:微科盟Tracy、江舜尧。
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暴露于热应激下会触发以热休克蛋白HSF1依赖性转录上调为特征的明确的急性反应。恢复的细胞将具有耐热性,但人们对这种适应性机制了解甚少。通过定量蛋白质组学,作者发现在获得耐热性的MCF7乳腺癌细胞中,HSP70家族伴侣HSPA1及其辅因子HSPH1和DNAJB1选择性上调。HSPA1在热应激反应中具有双重功能:(i)在急性应激中,它促进26S蛋白酶体募集到翻译的核糖体中,从而为细胞快速降解蛋白质和恢复时合成蛋白质奠定基础;(ii)在耐热性期间,HSPA1与HSPH1一起将泛素化的新生/新合成蛋白质维持在蛋白酶体有效清除所需的可溶状态。HSPH1的缺失同样会阻碍小鼠的耐热性和食道肿瘤的生长,从而为高HSPH1的消化道癌预后不良和试图将HSPH1作为癌症药物靶点提供了可能的解释。作者阐述了HSPA1单独或与HSPH1、DNAJB1结合时在促进新生/新合成蛋白质的质量控制和细胞耐热性中的双重作用。
论文ID
原名:Dual roles of HSP70 chaperone HSPA1 in quality control of nascent and newly synthesized proteins译名:HSP70分子伴侣HSPA1在新生和新合成蛋白质质量控制中的双重作用
期刊:The EMBO Journal
IF:9.889发表时间:2021.05通讯作者:程亚彬、Dieter A Wolf 通讯作者单位:厦门大学
实验设计
实验结果
为了研究对热应力的动态响应,作者设计了通过温度变化诱导MCF7细胞热耐受性的方案。将细胞暴露于42℃ 1小时,然后在37℃恢复4小时(图1A)。初次热处理MCF7细胞(42℃持续1 h)不会导致细胞从组织培养板上脱落或明显的细胞死亡(图EV1A);但是,MCF7细胞长时间暴露于45℃,在热应激的刺激下,细胞活力迅速丧失,这表明了它们对热应激的敏感性;相反,经历了耐热性诱导方案的MCF7细胞在45℃时存活率明显提高(图1B)。文中将通过此温度转换程序适应性耐热的MCF7细胞称为MCF7aTT细胞。热应激会在翻译起始和延伸水平上迅速抑制蛋白质合成。使用蔗糖密度梯度离心法,作者发现将MCF7细胞暴露于42℃热激1 h后,多核糖体与单核糖体的比例大大降低(图1C),这表明蛋白质合成受到抑制。相反,MCF7aTT细胞中的蛋白质合成对热应激具有一定程度的抵抗力(图1C)。因此,此处开发的热应激和恢复模型激活了一个自适应程序,该程序可防止热诱导的翻译停滞并诱导MCF7细胞的耐热性。
A,将MCF7细胞转变为耐热MCF7aTT细胞的温度转换程序的示意图。B,通过台盼蓝染色可确定MCF7和MCF7aTT细胞在45℃时对热刺激的敏感性。该图显示平均值±SD,n=3。数字表示P值。C,通过蔗糖密度梯度离心分离MCF7和MCF7aTT细胞的裂解物(通过A中所述的方法赋予耐热性),并通过整合单染色体和多染色体峰面积确定P/M比(条形图,平均P/M比±SD ,n=6)。条形上方的数字表示通过Benjamini,Krieger和Yekutieli的两阶段线性步进过程计算出的P值。 2.蛋白质组学对热应激的反应:耐热细胞选择性上调HSPA1及其辅助伴侣DNAJB1和HSPH1
为获得对耐热性程序的客观评价,作者对暴露于42℃并在37℃恢复的MCF7细胞进行了基于SILAC的定量蛋白质组学,然后对具有热应激的细胞进行了新的分析。总共定量了这三种条件共有的1,554种蛋白质,并通过无干预的自组织图算法对它们的相对丰度进行了聚类。不出所料,热应激对MCF7细胞的蛋白质水平产生了深刻的影响,导致数百种蛋白质的上调和下调(图2A)。热激后恢复期间,某些变化持续存在,而其他变化是短暂的,在恢复后可基本恢复(图2A)。在回收的热适应的MCF7aTT细胞中,大量蛋白质也被选择性诱导或抑制,表明MCF7aTT细胞已采用了不同于原始MCF7细胞的新稳态(图2A)。用热应激再次挑战MCF7aTT细胞会导致明显的蛋白质组学反应,尽管这种反应与MCF7细胞明显不同(图2A)。蛋白质组学图谱表明,耐热性的获得与采用新的稳态相吻合,该稳态不会使热应力减弱,而是引发了不同的响应模式。为了表征这种模式,作者重点研究了在各种处理下变化出最显著的蛋白质。作者进行了三个比较:(i)暴露于42℃的热应激的MCF7细胞与维持于37℃的MCF7细胞(42℃ / 37℃;急性热应激);(ii)从热应激恢复后得到的MCF7aTT细胞与在42℃下热应激的MCF7细胞(aTT /42℃);(iii)MCF7aTT与MCF7aTT细胞再次暴露于42℃(aTT 42℃/aTT)。与图2A不同,在此方案中,作者未设置单个初始不受干扰的参考(即在37℃下未处理过的MCF7细胞)去测量响应于每个顺序处理的蛋白质表达变化。但是,在执行实验方案期间,作者对每一个组相对于其先前状况进行了量化,这使他能够查明热应力引起的与新获得的MCF7aTT细胞稳态之间的偏差(图2B)。正如预期的那样,三个实验组蛋白质比率都显示出以1.0的平均比率为中心的近似正态分布(图2B)。在每个实验组中,作者识别出约100种蛋白被上调,而大约相等数量的蛋白被下调(Z分数> 1,<-1,图2B)。对比这些富集在基因本体集群的蛋白质,作者发现在急性热应激下,在MCF7细胞中上调的蛋白质集丰富了mRNA剪接和线粒体蛋白质的导入,而下调的蛋白质集又丰富了与以下相关的蛋白质集合成(图2C)。后一个发现与响应热应激快速抑制蛋白质合成相一致(图1C)。数据也与作者先前观察到的响应于外源应激的线粒体蛋白产量增加的观察结果一致,这可能是对应激诱导的线粒体呼吸抑制的补偿性反应。随着细胞从热应激中恢复,它们上调了与蛋白质合成、热休克反应和自噬有关的功能,同时下调了与内质网应激和翻译保真度有关的其他蛋白质质量控制功能。这种反应标志着细胞可能从急性应激中恢复并获得了新的适应性稳定状态,其特征是应激防御机制(例如自噬)的持续上调。这种蛋白质组学特征与作者在MCF7aTT细胞(图1C)中观察到的蛋白质合成的恢复相一致,这在另一项近期研究中也已见到。为了应对急性热应激,耐热的MCF7aTT细胞表现出显著的线粒体呼吸链上调、氧化应激防御和共翻译蛋白质量控制,而作者在MCF7细胞未观察到这种反应(图2C)。蛋白质组学数据有力地表明,新获得的稳定的适应性强的耐热MCF7aTT细胞由于增加的能量产生,压力防御和蛋白质质量控制机制能够改善对急性热应激的反应。上述结论促使作者在热应激和恢复时间过程中对比各个分子伴侣的动力学,热激诱导1-4小时产生的分子伴侣来自于HSP10、20、40、60、70和90家族(图2D)。但是,在HSP70家族成员中,只有HSPA1保持升高,并且实际上在恢复过程中被过度诱导。值得注意的是,在恢复过程中,另外两种与HSPA1协同作用构成蛋白分解酶复合物的组分的蛋白,HSP40家族成员DNAJB1和HSPH1,即HSPA1的同源核苷酸交换因子(NEF),也被诱导表达(图2D)。在急性热应激期间,其他HSP70 NEF(包括HSPH2和HSPH3)均被下调,而恢复过程中恢复基础水平(图2D)。免疫印迹分析证实了HSPH1和HSPA1在恢复过程中的选择性诱导和强大的持久性,表明这些分子伴侣在耐热性中的独特参与(图EV1B)。计算绝对蛋白质量的归一化光谱丰度因子显示,HSPA1是MCFaTT细胞中最丰富的HSP70家族成员(图EV1C)。同时,DNAJB1和HSPH1是耐热细胞中最丰富的HSP40和NEF。为了确定HSPA1上调是否介导了耐热性,作者使用HSP70抑制剂VER-155008。尽管该抑制剂本身对MCF7aTT细胞的生存力没有影响,但它有效地逆转了MCF7aTT细胞的耐热性(图2E和EV1D)。蛋白质组学和细胞生存力数据共同证明HSPA1及其伴侣HSPH1和DNAJB1的选择性诱导介导了耐热性。
A,热图总结了热应激MCF7细胞和耐热MCF7aTT细胞中1,554种蛋白质的定量变化。彩色条定义了相对于MCF7细胞在37℃下蛋白质水平的蛋白质表达倍数变化。B,在所示比较中蛋白质的Log2倍数变化分布。上调和下调的蛋白质部分以红色和蓝色突出显示。比较的条件显示在左上方的方案中。C,热图显示了(B)中上调和下调的蛋白质中基因本体学功能集群的富集。基于累积的超几何分布计算P值。D,热图显示了通过SILAC蛋白质组学确定的热激暴露和恢复(MCF7aTT)期间MCF7细胞中分子伴侣和蛋白酶体亚基表达的变化。E,将MCF7细胞和MCF7aTT细胞暴露于指定的应激条件下3小时,并通过用台盼蓝染色死细胞来评估细胞活力。条形图代表台盼蓝排除细胞的百分比。(平均值±SD,n=3,竖线上方的数字表示通过Benjamini,Krieger和Yekutieli的两阶段线性步进过程计算出的P值)。 3.耐热细胞通过增加HSP70活性而免受泛素化蛋白聚集的影响
已知HSPA1,HSPH1和DNAJB1(HHD)的复合物以及相关的HSP70-HSPH-J结构域蛋白复合物在蛋白质分解和激活中的活性,作者试图测试MCF7和MCF7aTT细胞在热诱导的变性蛋白聚集体累积方面是否有所不同。作者通过高速离心将总细胞裂解液分离为可溶组分和不可溶组分,并对其进行SDS-PAGE分析;用SYPRO Ruby染色凝胶,然后进行定量成像,发现热应激的MCF7和MCF7aTT细胞之间在可溶组分或不溶组分方面均无重大差异(图3A)。但是,在HSP70抑制剂VER-155008存在的情况下,作者将MCF7细胞暴露于热应激下会导致不溶部分的增加(图3A),这种增加在MCF7aTT细胞中不明显(图3A)。这些数据表明,通过定量蛋白质组学在MCF7aTT细胞中发现的HSPA1-HSPH1-DNAJB1(HHD)复合体的选择性上调可能有助于选择性地促进热应激过程中蛋白质子集的溶解性。维持多肽溶解度对于26S蛋白酶体有效降解聚泛素化蛋白质至关重要。此外,热应激会触发受损蛋白质的聚泛素化,并随后通过蛋白酶体将其降解清除。因此,作者评估了用赖氨酸48(K48)-连接的多聚泛素链修饰的蛋白质的溶解度,该链可以将底物靶向到蛋白酶体上。在总的MCF7细胞裂解物中,K48-多聚泛素化的蛋白质响应热应激(42℃持续1 h)和蛋白酶体抑制剂MG132累积(图3B)。同时热激并添加HSP70抑制剂VER-155008与单独热激不同,并不会导致K48多泛素化蛋白的进一步增加。值得注意的是,热激MCF7aTT细胞未显示出K48多聚泛素化蛋白的累积(图3B),但用MG132处理后又恢复了热诱导的K48-多聚泛素化蛋白的累积。这表明在MCF7aTT细胞中缺乏K48多聚泛素化蛋白的累积不是由于细胞泛素化活性降低,而是由于蛋白酶体清除率增加。同样,VER-155008恢复了热激后MCF7aTT细胞中K48多聚泛素化蛋白的累积,这表明在耐热细胞中发现的HSP70水平升高可促进K48多聚泛素化蛋白的降解。用MG132处理未加工的MCF7细胞时,大多数聚泛素结合物是可溶的(图3C和D);然而,响应热激而累积的聚泛素化蛋白质中约有60%是不溶的(图3C和D)。将热激的MFC7细胞与HSP70抑制剂VER-155008一起温育可进一步将不溶性泛素化蛋白的比例提高至80%左右,这表明细胞需要HSP70活性来维持热损伤的多聚泛素化蛋白的溶解度。与MCF7细胞不同,响应热应激在MCF7aTT细胞中累积的大多数聚泛素化蛋白保持可溶,最可能的原因是在耐热性细胞中诱导产生了大量的HSPA1(图2D)。事实上,添加VER-155008会导致MCF7细胞不溶性复合物的增加,尽管观察到的比未使用过的少。因此,与蛋白酶体抑制剂不同,热应激和HSP70抑制引起不溶的泛素化蛋白累积,这些蛋白似乎对蛋白酶体降解具有抗性。这些数据表明,热适应细胞中选择性诱导的HSP70分子伴侣,特别是HHD复合物,部分通过维持泛素化的蛋白质的溶解度和清除率来增强耐热性,这些蛋白质在蛋白毒性应激反应中被泛素化。
A,如材料和方法中所述制备暴露于热休克和/或蛋白酶体(MG132,20μM,1 h)和HSP70抑制剂(VER-155008,50μM,1 h)的MCF7和MCF7aTT细胞的完整裂解液。总裂解物,可溶组分和不溶组分用SYPRO Ruby染色(左)并定量(右)。(平均值±SD,n = 3,竖线上方的数字表示通过Benjamini,Krieger和Yekutieli的两阶段线性步进过程计算出的P值)。B,测定与(A)中相同的总裂解物中K48连接的聚泛素化水平。肌动蛋白为内参。从多个独立重复中定量K48连接的聚泛素化水平。(平均值±SD,n = 5,竖线上方的数字表示通过Benjamini,Krieger和Yekutieli的两阶段线性步进过程计算出的P值)。C,测定(A)中所示的可溶和不溶组分的K48连接的聚泛素化水平,并对聚泛素化的蛋白质进行定量(蓝线,均值±SEM,n=4,柱上方的数字表示P值)。将(A)中获得的大块蛋白质的数据覆盖在图表上以进行比较(红线,均值±SEM,n=3)。 4.耐热细胞通过增加HSPA1向多聚核糖体的募集而免受新合成蛋白泛素化的影响
已知新合成的蛋白质优先受到应激诱导的泛素化和蛋白酶体降解。新生蛋白在哺乳动物细胞中经历共翻译泛素化的比例为11–14%,这一数字几乎是对蛋白毒性应激或抑制HSP70作用的两倍。新生蛋白对热应激诱导的泛素化的优先敏感性,以及在聚泛素化蛋白的溶解度方面对HSP70活性的独特要求,提出了一种有趣的可能性,即HSP70依赖性清除泛素化新生蛋白有助于耐热性。为了解决这个假设,作者首先确定了热激对蔗糖密度梯度上K48泛素化蛋白分配的影响,该密度梯度将翻译活性多核糖体与40S和60S单核糖体分开。尽管MCF7细胞在多核糖体组分中仅显示K48多聚泛素化蛋白的一小部分,但暴露于热应激或MG132的细胞却显示出多核糖体泛素化的强烈增加(图4A)。多核糖体泛素化的增加与多核糖体/单核糖体比率的降低形成对比,表明尽管应激细胞中新生蛋白质减少,但合成的那些蛋白质仍被K48多聚泛素链广泛修饰。由于核糖体本身会在应激条件下发生泛素化作用,因此作者试图排除在蔗糖密度梯度上观察到的K48多聚泛素信号只反映核糖体蛋白的泛素化作用(RPs)。通过免疫印迹,作者未观察到与单泛素化或多泛素化形式一致的RPS19或RPL7。这些发现与以前的报道一致,即RP泛素化主要通过单泛素发生,并且是由ER应激而不是由热应激或抑制HSP70选择性触发的。酵母中的RP多泛素化被证明是通过K63连接的链发生的,而不是K48连接的链。为了进一步确定应激诱导的多聚体K48多聚泛素化反应反映了新生蛋白质的修饰,作者测试了通过将细胞与tRNA类似物嘌呤霉素一起孵育,从多核糖体中释放新生链是否会降低K48多泛素化蛋白质的多聚体水平。新生链的释放降低了多核糖体中的K48多聚泛素信号(图4B),表明该信号的大部分来源于新生多肽。嘌呤霉素样品中残留的多聚体K48-聚泛素信号可能是由于新生链释放不完全所致。在一个单独的实验中,MCF7细胞中新生的嘌呤霉素化蛋白与K48多聚泛素链在免疫纯化时会被共纯化,同时,热应激和MG132会大大增加这种效果(图4C)。因此,新生蛋白多泛素化是应激诱导的,并且在多核糖体中很容易出现。值得注意的是,MCF7aTT细胞在热应激后未显示多聚体部分中K48多聚泛素化的大量累积(图5A)。然而,用VER-155008处理虽然重抑制了多核糖体/单核糖体的比例,但仍恢复了多核糖体多聚泛素化(图5B)。作者通过蛋白质组学发现MCFaTT细胞中HSP70活性的诱导对于防止多聚泛素化的新生蛋白质累积和热激时的翻译停滞都是必不可少的;同时MCFaTT细胞中HSPA1的诱导导致其与多核糖体的共分离增加(图5C)支持了这个推测,这一发现与HSPA1与核糖体的公认相互作用。与MCF7细胞一样,MG132导致多核糖体K48多聚泛素化在MCF7aTT细胞中明显累积(图5B)。在缺乏MG132的情况下缺乏聚泛素化物质的累积是由于HSP70依赖的MCF7aTT细胞通过蛋白酶体快速清除受损蛋白质的能力增强所致,而不是防止蛋白质损伤或抑制泛素化机制。为了测试总细胞蛋白(图3)中的HSP70活性是否也维持多核糖体部分中存在的泛素化蛋白的溶解性,作者通过有或没有VER-155008的条件下热激MCF7和MCF7aTT细胞中并通过30%蔗糖缓冲液分离80S核糖体与EDTA。通过高速离心将得到的蛋白质裂解物分离成可溶性上清液和不溶性沉淀,并且用K48-ub抗体对不同组分进行免疫印迹。热应激导致多聚体来源的K48-ub蛋白在MCF7细胞分离的不溶组分中比MCF7aTT细胞有更强的累积(图5D)。VER-155008恢复了在MCF7和MCFaTT细胞中用K48多聚泛素修饰的不溶性多核糖体衍生蛋白的累积,这表明HSP70限制了与多核糖体共同分离的K48-泛素化蛋白的溶解度限制,而多核糖体最有可能代表新生多肽。
A,将暴露于蛋白酶体抑制剂MG132(20μM,1 h)或热休克(42℃,1 h)的MCF7细胞的裂解液进行蔗糖密度梯度离心。从254 nm的UV迹线定量分析单体和多核糖体组分。定量了在组分4–6中洗脱的单核糖体和在7–14中洗脱的多核糖体,并计算了多核糖体与单核糖体(P/M)的比率。平均比率和单个数据点(n=5)显示在条形图中(平均值±SD)。条形上方的数字表示通过Benjamini,Krieger和Yekutieli的两阶段线性步进过程计算出的P值。通过用K48特异性抗体进行免疫印迹,分析了梯度组分中K48多聚泛素化蛋白的存在。右边的线图是相对于保持在37℃的MCF7细胞中获得的水平,跨梯度的K48多聚泛素化蛋白的定量(平均值±SEM,n=4)。B,与(A)中描述的实验相同,但MCF7细胞暴露于MG132(20μM,1 h)或嘌呤霉素(100μg/ml,10分钟)。平均值±SEM,n=2。C,如图所示,将暴露于MG132(20μM,1 h)或嘌呤霉素(100μg/ml,10分钟)的MCF7细胞的裂解液与抗嘌呤霉素抗体进行免疫沉淀,然后测定K48泛素化蛋白的共沉淀。肌动蛋白为内参。
A,如图所示(图4A)中的实验,使用MCF7和耐热MCF7aTT细胞。平均值±SEM,n=3,* P<0.05,** P<0.01(通过Benjamini,Krieger和Yekutieli的两阶段线性步进程序计算)。B,与(A)中相同的实验,将MCF7aTT细胞与HSP70抑制剂VER-155008(50μM,1 h)或MG132(20μM,1 h)孵育。以从核糖体蛋白RPS19和RPL7获得的信号作为参考,记录残留的多核糖体,尽管其UV平坦。右图是K48-ub的定量(平均值±SEM,n=2),黑色竖线表示由于泳道容量的限制,在不同凝胶上电泳的泳道的拼接。条形图表示P/M比率(平均值±SD,n=3,条形图上方的数字表示通过Benjamini,Krieger和Yekutieli的两阶段线性步进过程计算的P值)。C,通过免疫印迹测定(B)中描述的蔗糖密度梯度的HSPA1和HSPH1的分配。HSPA1数据以线形图进行量化(平均值±SEM,n=4)。D,通过30%的蔗糖溶液离心细胞裂解液以沉淀多核糖体。通过将80S核糖体与EDTA分离,可以从多核糖体中释放出新生蛋白(参见附录图S3)。通过离心制备可溶性和不溶性组分并测定K48连接的聚泛素的水平。定量K48连接的聚泛素的水平(平均值±SD,n=3)。黑色方块内的免疫印迹在相同的凝胶上电泳,白线划分无关的泳道。 5.HSP70促进蛋白酶体向多聚体募集
以上研究表明,HSP70活性在蛋白酶体降解靶向多聚泛素化的新生多肽中具有重要作用,该过程在HHD复合体水平升高的耐热细胞中更为有效。这需要一种机制来招募蛋白酶体以延长80S核糖体。此外,26S蛋白酶体和HSP70与核糖体发生物理相互作用增加了HSP70可能促进蛋白酶体募集到核糖体的可能性。通过测量蔗糖密度梯度部分中的蛋白酶体活性,作者观察到总细胞蛋白酶体活性的一小部分与MCF7细胞的多核糖体共分离(图EV2A)。共分离取决于多核糖体的完整性,通过将细胞裂解物与RNAse I孵育可以改变这种结果(图EV2A),表明了蛋白酶体与活性核糖体的相互作用。使用相同的测定,作者发现在热应激下或与MG132孵育细胞后,蛋白酶体在多核糖体部分中的累积增加(图6A)。在MCF7细胞以及另一种细胞系AD293中用蛋白酶体抗体进行免疫印迹也显示了这一点(图EV2B)。由于蛋白酶体的累积与多聚体K48多聚泛素化的水平相关(比较图4A和6A),作者试图了解其是否依赖于新生肽泛素化的增强。为了测试这一点,作者在蔗糖密度梯度分离之前将重组去泛素化酶USP2添加到了细胞裂解物中。尽管USP2从多核糖体部分中广泛去除了K48连接的多聚泛素(图EV3A–C),但对蛋白酶体募集的影响很小(图EV3D)。这些发现表明,蛋白酶体募集至多核糖体是响应蛋白毒性应激,独立于新生链泛素化。由于蛋白酶体的丰度和活性以及组装成26S颗粒都不会因热应激而改变(附录图S4),因此作者测试了蛋白酶体活性在热应激细胞中的多核糖体累积是否是由于蛋白酶体向多核糖体的募集增加所致。暴露于热应激或MG132的MCF7细胞裂解物通过30%蔗糖缓冲液离心被分离多核糖体,然后作者通过免疫印迹来共分离蛋白酶体亚基。暴露于热应激或MG132导致多核糖体组分中回收的19S和20S蛋白酶体亚基大大增加(图6B)。为了确定这种共分离是否反映了核糖体-蛋白酶体的物理相互作用,作者从蔗糖密度梯度中收集了多核糖体组分,并用抗RPS19抗体对其进行了免疫沉淀,通过LC-MS/MS分析免疫纯化的材料。无标记的定量显示了80S核糖体与蛋白酶体亚基的共纯化(图6C)。当细胞暴露于MG132时,相互作用增加;另外,MG132处理的19S和20S蛋白酶体之间的相互作用明显稳定(图6C)。在类似的实验中,作者用RNA酶I消化了多核糖体部分,以释放80S颗粒。然后,作者使用抗RPL7的抗体免疫纯化80S复合物,并通过免疫印迹测定了蛋白酶体亚基的共纯化。作者发现几个19S和20S蛋白酶体亚基与多核糖体核糖体共纯化(图EV4A)。对于ADRM1和PSMA1-6,作者观察到了响应热应激和MG132的核糖体相互作用的明显增加,特别是考虑到从应激细胞中回收多聚体来源的80S复合物的可能性较低时(图EV4A)。在使用总细胞裂解物的对等实验中,作者发现两种纯化26S蛋白酶体的不同方法,导致了40S和60S RPs的易于检测和特异性共纯化(图EV4B和C)。为了生化证实HSP70活性可促进26S蛋白酶体向新生肽的募集,作者使用嘌呤霉素标记和pull-down从HSPA1和其他HHD亚基水平升高的MCF7aTT细胞中分离出新生肽。一些细胞样品还通过VER-155008灭活HSP70或MG132抑制蛋白酶体的活性。在MG132处理的细胞中作者观察到的蛋白酶体亚基ADRM1和PSMA1-6与新生链结合完全取决于HSP70活性(图6D)。在上述用MCF7aTT细胞进行的实验中,作者注意到蛋白酶体与新生链的HSP70依赖性相互作用仅在用MG132处理细胞时才明显。而在MCF7细胞中,即使没有MG132的情况下蛋白酶体募集到多核糖体中的现象也很明显(图6A)。因此,作者探讨了MCF7aTT细胞中HSPA1向多核糖体募集可能促进泛素化新生蛋白的蛋白酶体降解,从而减少蛋白酶体在核糖体上的停留时间。确实,当蛋白酶体降解被MG132抑制时,蛋白酶体似乎被困在MCF7aTT细胞的多核糖体部分中(图6E)。因为VER-155008降低了HSPA1的活性,所以这种明显的结果取决于HSPA1的活性(图6E)。在暴露于热激的MCF7细胞中,蛋白酶体募集到多核糖体对HSPA1活性的依赖性也很明显(图EV5)。综上所述,HSP70可将蛋白酶体募集到热损伤的新生蛋白质上,从而促进新合成蛋白质的质量控制和耐热性。
A,使用体外测定法以蔗糖密度梯度测定蛋白酶活性。以37℃的MCF7细胞中获得的蛋白酶活性作为对照。(平均值±SEM,n=4)。B,将MCF7细胞暴露于蛋白酶体抑制剂MG132(20μM)或42℃下1 h,然后通过30%的蔗糖梯度离心的细胞裂解液。测定所得多核糖体的26S蛋白酶体亚基和HSPA1的水平。C,通过蔗糖密度梯度离心分离保持在指定条件下的MCF7细胞的细胞裂解物。用RPS19抗体对多核糖体进行免疫沉淀,并通过定量LC-MS/MS分析沉淀。热图表示归一化光谱丰度因子(NSAF)。D,从MCF7和耐热的MCF7aTT细胞制备总的细胞裂解物,并按方案所示将嘌呤霉素标记的肽拉下。通过免疫印迹分析沉淀物中K48连接的聚泛素,分子伴侣和蛋白酶体亚基。E,通过免疫印迹评估在指定条件下20S蛋白酶体亚基PSMB1沿蔗糖梯度的分配,黑色竖线表示由于泳道容量的限制,在不同凝胶上泳道的拼接。顶部的线图显示了相同比例的胰蛋白酶样蛋白酶体活性(平均值±SD,n=3)。 6.HSPH1失活抑制食管癌细胞的耐受性
为了检验上述推测,作者试图从基因上使HHD复合物失活。但作者未能成功地用CRISPR/Cas9干扰MCF7细胞中的HSPA1或HSPH1,可能是因为这些细胞的基因组接近四倍体。对癌细胞的相关搜索显示,在来自40个不同组织的人类癌细胞系组中,食管癌细胞系是HSPH1 mRNA表达最高的细胞系(图S5A)。同样,食管癌细胞系在HSPA1 mRNA表达方面排名第七(图S5B)。因此,作者尝试使用CRISPR/Cas9来敲除人食管癌细胞系KYSE150中的HSPA1和HSPH1。虽然作者未能成功干扰HSPA1,这可能表明了其重要性,但作者通过CRISPR/Cas9敲除获得了几种可行的食管癌HSPH1敲除细胞系(KYSE150HSPH1-/-;图7A)。KYSE150HSPH1-/-细胞在45℃时对热休克的敏感性仅比亲代KYSE150细胞略高,KYSE150细胞与MCF7细胞相比具有相对耐热性(图7B,比较图1B)。但是,在用MG132和VER-155008附加胁迫后,HSPH1敲除细胞显示出明显的热敏性(图7C)。KYSE150HSPH1-/-细胞缺乏适应性耐热性。尽管通过与MCF7aTT细胞相同的温度转换方案使亲本KYSE150细胞具有耐热性(图1A),在热休克1小时后不再显示多泛素化蛋白在多核糖体富集,但经过相同处理的KYSE150HSPH1-/-细胞仍然累积了大量的多泛素化蛋白在多核糖体中(图7D)。与VER-155008处理的MCF7细胞一样(图3C),HSPH1缺失的KYSE150细胞在维持热休克时累积的K48泛素化蛋白的溶解性方面也存在缺陷(图7E),从而为HHD复合体的概念提供了进一步的遗传支持,即通过溶解泛素化的蛋白使它们能被蛋白酶体清除来介导耐热性。然而,值得注意的是,热诱导的蛋白酶体募集到多核糖体并不依赖于HSPH1,因为它在KYSE150和KYSE150HSPH-/-细胞中均发生(图7F)。这一发现表明,蛋白酶体的多核糖体募集只需要HSPA1,而不需要HSPH1。与单纯的KYSE150细胞相比,耐热性和热休克后的KYSE150aTT细胞显示多核糖体的蛋白酶体募集水平较低(图7F)。这印证了先前在MCF7aTT细胞中所做的观察,耐热细胞中蛋白酶体的多核糖体停留时间减少了(图6E和EV5)。即使在耐热诱导方案之后的KYSE150HSPH-/-细胞中,蛋白酶体向多核糖体的募集也减少了,随后对细胞进行热激(图7F),即使它们在多核糖体中累积了大量的K48泛素(图7D),这很可能是不溶的,蛋白酶体拮抗状态(图7E)。该结果表明蛋白酶体募集到新生蛋白很大程度上与泛素化无关(图EV3),而蛋白酶体遇到抗降解的泛素结合物时从核糖体脱离是一种未知机制。
A,通过CRISPR/Cas9靶向破坏HSPH1的KYSE150细胞的单个克隆的免疫印迹(KYSE150HSPH1-/-细胞)。B,破坏HSPH1对应激敏感性的影响。将KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞暴露于热应激(45℃;平均值±SD,n=3)并通过用台盼蓝染色来评估细胞活力。C,将KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞暴露于所示的应激条件下,并通过用台盼蓝染色来评估细胞活力。图表表示平均值±SD,n=3,柱形上方的数字表示通过Benjamini,Krieger和Yekutieli的两阶段线性步进程序计算的P值。D,将未处理或经过aTT温度转换程序的KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞暴露于指定的温度,并通过蔗糖密度梯度离心分离细胞裂解液。通过梯度部分的免疫印迹检测到K48连接的聚泛素(左图)。信号被量化并显示为折线图(右图,平均值±SEM,n=2)。红色框突出显示了KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞之间的多核糖体多泛素化作用的明显差异。E,将暴露于指定温度条件(aTT方案和热激)的KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞的全部裂解液分为可溶和不可溶组分。分析了不溶组分的K48连接的多聚泛素的水平(左图)。显示HSPA1和HSPH1的总水平以供参考。定量K48泛素信号并显示在条形图中(平均值±SD,n=4)。F,获得暴露于指定温度条件(aTT方案和热激)的KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞的裂解物,并通过30%蔗糖梯度离心分离多核糖体。通过免疫印迹测定全细胞裂解物(左图)和多核糖体沉淀物(右图)的HSPH1,HSPA1和蛋白酶体亚基的水平。 7.HSPH1在消化道肿瘤中的表达增加,是小鼠肿瘤形成所必需的
为了将作者的体外观察纳入生理学背景,作者转向了食管鳞状细胞癌(ESCC),这是中国第四大常见癌症。作者对一组ESCC和口腔鳞状细胞癌(OSCC)以及匹配的正常组织的石蜡包埋组织样品进行了免疫组化分析。定量评分显示,与周围的正常组织相比,ESCC和OSCC中的细胞质和核HSPH1明显过表达(图8A和B)。尽管在这些组样品中的肿瘤和对照中的HSPA1表达之间未观察到差异,但是在一系列182个ESCC样品中,HSPH1 mRNA的高表达与预后不良密切相关(P=0.035;图8C)。大批头颈部和肝癌也存在与不良预后的相似相关性。这些数据表明,癌症通过上调共翻译的耐热途径获得了生长和生存优势。为了验证这一推测,作者测试了亲本KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞在裸鼠中形成肿瘤的能力。皮下注射细胞,并在29天的时间内测量肿瘤大小。如通过测量随时间推移的平均肿瘤大小,平均终末肿瘤重量和单个肿瘤大小所显示的,源自KYSE150HSPH1-/-细胞的肿瘤生长受到损害(图8D和E)。免疫组化和免疫印迹证实KYSE150HSPH1-/-肿瘤中HSPH1蛋白严重降低。同时,不同大小的宿主动物体重未反映出肿瘤大小的差异。
A,口腔鳞状细胞癌(OSCC)和食道鳞状细胞癌(ESCC)衍生的组织切片的代表性显微照片,通过免疫组织化学(IHC)进行了抗体染色。顶部显示常规的H&E染色。黑色正方形指向在右侧相邻图片中放大的区域。B,对指定数目的正常,OSCC和ESCC组织进行了HSPA1和HSPH1的IHC染色。对染色强度进行评分。C, Kaplan–Meier图显示了HSPH1mRNA表达水平与ESCC患者生存率之间的相关性。在默认设置下使用Pan Cancer算法从KM Plotter获取表达数据并对其进行可视化。D,将KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞注射入裸鼠,并随时间监测异种移植肿瘤的生长(左图;平均肿瘤体积±SEM,n=4,每n有5只动物)。确定了实验结束时的平均肿瘤重量(平均值±SD,n=4,每n有5只动物,条形图上方的数字表示P值,* P <0.05,** P<0.01 [以2为基数,Benjamini,Krieger和Yekutieli的阶段线性步进程序])。E,源自KYSE150和KYSE150HSPH1-/-细胞的代表性肿瘤的宏观图像(显示的是来自四个独立实验中的两个的肿瘤)。
讨论
在急性热应激和恢复过程中采用蛋白质组分析,作者发现反应模式与促进细胞完整性和存活相一致。最显著的变化是HSPA1及其辅助因子HSPH1和DNAJB1的强烈上调(仅在耐热细胞中),众所周知,这是因为形成了HHD伴侣复合物。HHD已成为一种深入研究蛋白质分解/复性的物质。尽管人们对其生化机制的了解越来越多,但其在应激防御和人类疾病中的生理作用仍然不清楚。作者的一些发现表明,HSPA1单独或在HHD中,在新生/新合成蛋白质的质量控制中起着迄今尚未探索的作用,这些蛋白质在从热应激中恢复时尤为明显:i:在定量分析的17种HSP中,包括6个HSP70家族成员和3个HSP70 NEF中,只有HSPA1,HSPH1和DNAJB1在耐热性获得期间被选择性上调,使其成为热适应细胞中各自伴侣分子家族中最丰富的成员(图2D和EV1C)。ii:耐热细胞似乎不需要HSP70活性的上调来维持大分子蛋白的溶解性以应对热应激,而有可能是将HSPA1作为HHD的一部分。相反,如VER-155008处理和HSPH1的敲除所示,HHD可以响应热激,维持K48-多聚泛素修饰的多核糖体蛋白的溶解度(图3C和5D)。这与HSPH1参与蛋白酶体清除所需的热诱导的多泛素化蛋白聚集体的增溶作用是一致的。iii:作者的数据表明,HSP70活性是响应急性热激以及在耐热性期间26S蛋白酶体有效募集至多核糖体所必需的。此功能主要归因于HSPA1,因为它是耐热细胞中最丰富的HSP70蛋白,也可能是HSP70抑制剂VER-155008的主要靶标(图EV1B)。在热应激期间诱导的其他HSP70蛋白,HSPA5(GRP78,BiP)和HSPA9(GRP75)位于内质网和线粒体中,不太可能介导新生/新合成蛋白的质量控制。HSPA1在蛋白酶体募集到核糖体中的确切分子功能仍然未知。由于它对尚未诱导HSPH1的MCF7细胞(图2D)和KYSE150HSPH1-/-细胞(图7F)的急性热激反应相似,蛋白酶体向核糖体的募集似乎独立于HSPH1。一种可能是HSPA1通过核糖体和蛋白酶体上不同的结合位点,将它们的相互作用桥接在“translasome”颗粒中。因此,热应激细胞中HSPA1的增加可能独立于新生链泛素化而触发核糖体-蛋白酶体复合物(图EV3),并且完全不受新生链的影响;或者,增加HSPA1与新生链的相互作用可能会促进蛋白酶体募集。在这里,HSAP1可能在蛋白酶体穿梭的意义上发挥作用,尽管以泛素化非依赖性的方式起作用(图EV3)。这些模型的混合形式是可行的,其中新生链将稳定HSPA1-核糖体和HSPA1-蛋白酶体的相互作用,从而促进核糖体-蛋白酶体的相互作用。 2. 热应激反应的含义
作者对自适应耐热性范例的研究还揭示了协调细胞对热应激的反应分子事件的精确模型(图9)。一方面,作者观察到尽管HSPA1增强了蛋白酶体向核糖体的募集,但K48连接的聚泛素链在强烈应激细胞的多核糖体中累积。这表明在急性应激反应期间,新生/新合成蛋白质的蛋白酶体降解被阻止。例如,从机理上讲,这可能涉及通过蛋白酶体亚基ARDM1/RPN13的自身泛素化来抑制蛋白酶体降解。HSPH1是溶解多聚泛素化蛋白所必需的,在尚未诱导其表达的急性应激反应期间,HSPH1也可能限制了有效降解。急性应激后短暂抑制蛋白酶体降解可能会给伴侣分子提供重新折叠热损伤蛋白所需的时间。因此,HSPA1辅助的蛋白酶体募集到核糖体可能使细胞保持平衡,以快速清除受热不可逆转破坏的那些蛋白质,等待恢复信号。该信号可能是由于急性热应激缓解后HHD复合体的增强而产生的,导致蛋白酶体降解的激活和蛋白质合成的恢复。在没有这种缓解信号的情况下,如暴露于蛋白毒性应激的HSPH1敲除细胞和VER-155008处理的MCF7细胞(图2E)所示,细胞可能在翻译关闭时保持锁定状态并最终遭到不可弥补的损害。
在正常条件下(左图),细胞以高效率共翻译折叠新合成的蛋白质。不能正确折叠的适量新生肽将被泛素化并降解。HSPA1有助于蛋白酶体靶向,HSPA1的存在量足以防止受损的新生肽聚集影响蛋白酶体清除。响应急性热休克(中图),HSPA1受到限制,泛素化新生多肽的聚集阻止其被蛋白酶体降解。HSP70活性的限制导致eIF2α的磷酸化并影响翻译延伸的机制抑制整体蛋白质合成。同时,HSF1的激活导致转录诱导和HSPA1的合成。在具有耐热性的细胞中(右图),HSPA1,HSPH1和DNAJB1的水平升高可提高HHD分子伴侣复合物的活性,从而有助于蛋白酶体快速的清除。结果,eIF2α磷酸化减弱,尽管环境胁迫,细胞仍能维持蛋白质合成。通过上调该途径,包括食道和口腔鳞癌在内的肿瘤似乎获得了生存优势。 第二个关键的观察结果是,HHD升高的耐热细胞不再对热激1 h作出反应,而是多核糖体中聚泛素化蛋白的累积。从理论上讲,这可能是由于(i)受损蛋白的快速重折叠从而阻止了它们的泛素化或(ii)多泛素化的多核糖体蛋白的快速蛋白酶体降解。作者通过用MG132处理热应激的MCF7aTT细胞,多核糖体多泛素化得以完全恢复(图5B)验证了第二种情况。VER-155008(图5B)和HSPH1(图7D)表型MG132的敲除证实了在由急性热应激再次胁迫引起的耐热细胞新生/新合成蛋白快速降解中,HHD分子伴侣复合物起着重要作用。这些结果并未排除HHD在热变性蛋白的重折叠中的其他作用,尽管这种重折叠在哺乳动物细胞中比在酵母中显著慢,因此似乎不会在与作者观察相关的时间范围内发生。 3. 对癌症的影响
作者的研究结果还表明HSPH1或者 HHD在促进癌细胞在组织培养和动物宿主中的增殖中发挥了关键作用。已在多种人类癌症中发现了HSPH1的过度表达,包括结肠癌,黑色素瘤和非霍奇金淋巴瘤,而siRNA介导的敲低诱导了结肠癌细胞和胃癌细胞的凋亡。同样,作者在中国高患病率的消化道癌症中发现了HSPH1的强烈过表达(图8B),而高水平的HSPH1与这些癌症的患者预后不良相关(图8C)。这些观察结果表明,高水平的HSPH1将促进HHD复合物活性的增加,从而导致口腔癌和食道癌对治疗的抵抗力。更普遍地讲,高HHD可能使多种癌症适应肿瘤微环境的不利条件,其特征是代谢,遗传毒性和蛋白毒性应激的相互加强网络。这可以解释KYSE150HSPH1-/-细胞对应激源组合的敏感性,包括热,MG132和VER-155008。简言之,HSPH1在胁迫防御中的作用及其在多种癌症中的选择性上调可以将其指定为治疗干预的目标。针对HSPH1的首次尝试表明HSPH1有望是未来研究肿瘤干预治疗的途径。
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