科研 | Environ Exp Bot： 夜间高温胁迫下水稻种子的代谢研究

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

水稻成熟期夜间高温(High nighttemperature，HNT)严重影响产量和品质。HNT促进了胚的生长和谷粒发育过程中垩白的形成，并伴随着胚乳细胞大小的减小。虽然这些反应可能在谷粒中存在相互作用，但在加速胚胎发育过程中涉及到哪些信号尚不清楚。在这项工作中，我们使用picolitre压力探针电喷雾电离质谱（picoPPESI-MS）在HNT处理的谷粒、胚胎盾片和外胚乳的基部（成熟时的白垩状区域）和中部（成熟时的半透明区域作为参考）位置的几个区域进行了单细胞代谢组学研究。显微镜观察表明，HNT能促进鳞片细胞的扩张。当胚胎细胞膨胀率达到最大值时，我们检测到抗坏血酸-谷胱甘肽(ASC-GSH)途径和嘌呤等几种代谢存在空间差异，胚胎细胞中存在大量的糖和氨基酸积累。在HNT处理的胚胎细胞中，GSH含量没有处理差异，但由于氧化谷胱甘肽(GSSG)含量的降低，GSH/GSSG比值有所增加。在HNT条件下，随着ASC/脱氢抗坏血酸比值的不同，胚胎细胞中ASC积累也更大。由于休眠往往与GSSG浓度相关，因此我们在细胞水平上检测到GSH氧化还原稳态的空间调控可能是HNT处理的种子缓解休眠和促进胚胎生长的必要条件。

论文ID

原名：Metabolic coordination of rice seed development to nighttime warming:In-situ determination of cellular redox states using picolitre pressure-probe electrospray-ionization mass spectrometry译名：水稻种子发育对夜间增温的代谢协调：picolitre压力探针电喷雾质谱法原位测定细胞氧化还原状态
期刊：Environmental and Experimental Botany
IF：5.545发表时间：2021.05通讯作者：Hiroshi Wada
通讯作者单位：日本爱媛大学

实验设计

实验结果

1. HNT条件下稻米外观品质下降

与对照组相比，在HNT处理下糙米的外观变得不那么透明（图1A）。对照组的稻米外观由96.3%的PR、1.1%的BWR和WBR以及2.6%的其他谷粒组成，而数据显示，由BWR和WBR以及其他谷粒组成的垩白稻米在HNT处理中增加，分别达到58.9%和41.1%，导致PR显著下降（HNT处理下为0%）（图1B）。基部白色或白色背部的谷粒（低于阈值）被归类为其他谷粒（图1B）。 

图1（A）对照和HNT处理的成熟稻谷图像。（B）精米（PR）、基础白米（BWR）及其他谷粒的百分比。在PR、BWR加WBR和其他核中，观察到处理间的概率水平分别为0.001、0.05和0.05时的显著性。标尺为1厘米（A）。

2. HNT条件下显微镜观察

HNT处理的胚的干重高于对照(图2A)，而其余部分(胚乳加糊粉层和除胚外的果皮)成熟期的干重低于对照(图2B)。结果表明，HNT处理的胚干重与全粒干重之比大于对照(图2C)。数据显示，HNT促进了胚胎发育(图2A和D K)。我们观察到HNT增强的胚胎发育伴随着细胞大小的增加(即细胞扩张)(图2J和K和表S1)，胚胎面积与胚胎细胞面积呈线性回归(见图2K)。根据观察结果，我们在抽穗期后（days after heading，DAH）11天时进行了如下的picoPPESI-MS分析(见图2J和K箭头)。我们分别采用CBB和I2-KI染色来鉴定种子发育过程中各靶区蛋白质和淀粉体的分布；位于胚胎外部组织的盾片和外胚层被CBB(即浅蓝色)染色较少，这表明HNT处理后的胚胎细胞中淀粉体和蛋白体的含量比对照组少(图S1A -F)。我们对胚胎盾状细胞的仔细检查显示，细胞分裂活跃地发生在胚胎发育第9天，细胞形态没有明显的差异(图S1A和D)。在15 DAH时细胞相对膨胀率下降之前(图2K)，细胞中积累了大量细胞器，包括淀粉体、脂质体和蛋白质体，尽管HNT中淀粉体的大小比对照组小。

我们在HNT处理的细胞中也观察到一些空泡，但对照组很少（图S1B和E）。在35 DAH时的细胞中，我们在对照组中观察到较大尺寸的淀粉体，而HNT处理的细胞中胞浆中保留相对较小尺寸的淀粉体以及推测的脂质体、许多小空泡和PBs（图S1C和F）。此外，HNT处理的糊粉层在35DAH时比对照层厚（图S1G-L）。那些位于BOE的主要细胞器成分的时间变化过程（图S2）表明，在正常谷粒发育期间，淀粉体和蛋白体的百分比随着间隙面积的减少而增加（图S2A-C）。

15 DAH后，HNT处理的间隙面积百分比大于对照，而HNT处理的淀粉体和蛋白体百分比均低于对照（图S2G I）。在HNT处理的BOE细胞中，在35 DAH时观察到更高比例的空泡间隔区(图S2F和I)，导致形成白垩状的空气空间(图1A)。

图2 （A）胚的干重及（B）其余的核组织（即，除胚外的胚乳加上粉红层和果皮）。（C）成熟粒胚干重与干重之比。（D-I）对照组（D-F）和高温处理组（G-I），分别于9,15和35日大时，在果核切片的基部拍摄的光镜图像。用考马斯亮蓝和碘化钾对切片进行染色。al:糊粉层；e: 胚胎；oe：外胚乳；p：果皮；VB：维管束。采用picoPPESI-MS分析胚胎面积(J)和胚胎细胞(K)的变化时间过程(图3)。（K）中插入的图形显示了胚胎组织和胚胎细胞的关系；虚线表示线性回归线（r²=0.958，p<0.001）。（J和K）中的灰色区域表示HNT处理的持续时间。箭头指示执行picoPPESI-MS的11 DAH。（A-C）中的数据是来自5-6个单株的40-48个优质谷粒的平均SE。（J）为3个单株6 ~ 10个优粒的平均SE。(K)为3株植物84 ~ 180个单株细胞的平均SE。

3. HNT处理中细胞代谢物和氧化还原状态的同时测定

我们利用picoPPESI-MS在负离子模式下识别了一些代谢物信号(共130个信号)，与理论m/z值的差异小于5ppm(图3，表S2，也见图2)；去质子化离子物种[苹果酸-H]、[琥珀酸-H]、[谷氨酸-H]、[抗坏血酸-H]和[Hex2-H]的峰是主要信号峰，细胞组成存在显著的位点特异性差异，包括抗坏血酸-谷胱甘肽（ASC-GSH）循环相关代谢物、糖和氨基酸（图3，表S2）。

在发育胚（developingembryo，EMB）中，[柠檬酸-H]^-是一个主要信号，与分析的其他两个胚乳区有明显差异（表S2）。在HNT处理中，[M+Cl] ^-种类的抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，以及[M-H] ^-种类的乳酸、尿囊素、肉豆蔻酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的含量显著高于对照组，而HNT处理的去质子化脯氨酸的含量较低（表S2）。除GSSG外，HNT处理组与ASC-GSH途径相关的大多数代谢物均高于对照组。HNT处理的[M-H] ^-糖相关信号（M=Hex、Hex2、Hex3和戊糖）、作为[M+Cl]物种的双糖簇2（Hex2）和作为[M-H]的一系列脂肪酸的含量高于对照组（图4和5以及表S2）。

在BOE中，HNT处理后Hex、Hex3、pentose、pentose₂、抗坏血酸、单脱氢抗坏血酸（MDHA）、丙酮酸、富马酸、奎尼酸、莽草酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、硫酸、亚硫酸、腺嘌呤、水杨酸、细胞壁相关代谢物（如UDP-Hex和UDP-D-xyl/UDP-L-Ara）、对香豆酸以及Hex₂[M+Cl]^- 显著高于对照组；而亮氨酸/异亮氨酸、组氨酸和色氨酸的含量低于对照组（表S2）。总的来说，与TCA循环、ASC-GSH循环、大多数氨基酸和细胞壁合成相关的代谢物的含量在HNT处理组高于对照组（图4和5）。

相反，在成熟时被假定为半透明的MOE中，HNT处理的琥珀酸、缬氨酸和苏氨酸含量低于对照组（表S2），HNT处理组的ASC高于对照组（表S2）。除DHA外，HNT处理MOE细胞中ASC-GSH循环相关代谢产物的含量较对照组高；HNT处理的TCA循环相关代谢物、大多数氨基酸和脂肪酸含量低于对照组（图4和5）。

在所有区域，HNT处理组的氧化还原相关代谢物、ASC、MDHA、DHA、GSH和GSSG的含量均高于对照组（图4）。我们在HNT处理的每个代谢物中都观察到了空间浓度梯度（即EMB>BOE>MOE），但在HNT处理的胚胎中GSSG除外（图4）。在两种处理中，胚胎细胞中的ASC/DHA比率均低于胚乳（图4D）。在胚乳中，HNT处理的ASC/DHA比值比对照组高，但胚胎黄芩细胞的ASC/DHA比值则不高（图4D）。在HNT处理的胚乳中，MOE的ASC/DHA比率大于BOE，表现出相当大的差异（p=0.05）（图4D）。在胚胎细胞中，HNT条件下GSH/GSSG比率增加（图4G），HNT处理的胚胎中乳酸的含量大于BOE和MOE（表S2），乳酸在HNT处理中也表现出空间浓度梯度（表S2）。对于TCA循环相关代谢物的含量，在HNT处理后，我们MOE和BOE之间观察到相反的模式（图5）。此外，在所有三个位置，HNT处理的谷氨酰胺始终高于对照组（图5和表S2）。 

图3 从对照(A, C和E)和HNT处理(B, D和F)的EMB (A和B)、BOE (C和D)和MOE (E和F)细胞中获得的11 DAH负离子picoPPESI质谱。(B)的扩展质谱如图所示。每个处理3-11粒重复试验的数据具有代表性。BOE，基生外胚乳;EMB胚胎;MOE，中外胚乳。
 图4  对照组和HNT处理组的ASC（A）、MDHA（B）、DHA（C）、ASC/DHA（D）、GSH（E）、GSSG（F）和GSH/GSSG（G）的比值。计算各处理各部位MOE、BOE和EMB中GSH/GSSG比值的对数变换（logy+1）。（A-C）和（E-F）中的斜体值表示HNT与对照组的比率。ASC：抗坏血酸；APX：抗坏血酸过氧化物酶；BOE，基部外胚乳；DHA：脱氢抗坏血酸；DHAR：脱氢抗坏血酸还原酶；EMB，胚胎；GR：谷胱甘肽还原酶；GSH：谷胱甘肽；GSSG：氧化型谷胱甘肽；MDHA：单脱氢抗坏血酸；MDHAR：单脱氢抗坏血酸还原酶；MOE，中间的外胚乳。
 图5  在对照组和HNT处理组的EMB、BOE和MOE中检测到与糖酵解、TCA循环、发酵、氨基酸、细胞壁代谢、嘌呤分解代谢、脂肪酸和脂质合成有关的代谢产物。每个位置的HNT与控制的比率用色标表示（见左上角）。在每个框集中，EMB、BOE和MOE分别从左、中和右对齐。α-L-Rha：α-L-鼠李糖；Ala：丙氨酸；Arg：精氨酸；Asn：天冬酰胺；Asp：天冬氨酸；BOE，基部外胚乳；Cys：半胱氨酸；GABA：γ-氨基丁酸；EMB，胚胎；Gln：谷氨酰胺；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；His：组氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Lys：赖氨酸；Met：蛋氨酸；MOE，中外胚乳；OAS：O-乙酰丝氨酸；Orn：鸟氨酸；Phe：苯丙氨酸；Pro：脯氨酸；Ser：丝氨酸；Trp：色氨酸；Try：酪氨酸；UDP：尿苷二磷酸；UDP-D-Xyl：尿苷二磷酸-D-木糖；UDP-L-Ara：尿苷二磷酸-L-阿拉伯糖；Val，缬氨酸。

讨论

ASC和GSH都参与应激反应和发育调控。这些代谢物主要分布在细胞质、叶绿体、线粒体、细胞核、过氧化物酶体、液泡和胞外空间。这暗示总谷胱甘肽和GSH/GSSG比值可能是两个独立的系统，GSH/GSSG比值可能主要影响基因表达、蛋白功能和谷胱甘肽氧化还原电位。在大多数生物样品中，GSH氧化还原状态的测定(以GSH/GSSG比值表示)都是在组织水平上采用比色法、LC -MS或CE-MS作为氧化状态的指标。当收集目标细胞时，邻近组织的污染是任何解剖实验中的一个关键问题，特别是在胚胎/胚乳相互作用研究中，正如一些研究者所指出的那样。在HDT条件下处理的稻谷中，GSH/GSSG比值也有所增加。然而，据我们所知，还没有人试图实时测定单细胞水平上的比例以及溶质(代谢物)组成。

在本研究中，我们使用picoPPESI-MS直接进行细胞特异性代谢组分析，研究水稻种子对HNT的细胞代谢反应及其与胚胎发育的关系(图2)，成功同时测定了GSH/GSSG和ASC/DHA比值。结果显示，在相同的谷粒中，细胞氧化还原状态的空间模式以及显著的代谢改变，包括嘌呤分解代谢产物尿囊素和乳酸，如下所述。除了胚胎细胞中GSSG含量和MOE中DHA含量下降外，在HNT处理中，我们甚至在白天也观察到包括GSH在内的所有部位氧化还原相关代谢物的总体增加(图4)。在松树胚萌发时，GSSG也有类似的减少。由于ROS清除主要通过ASC-GSH循环进行，我们的数据表明，在HNT处理的胚胎细胞中，维持一定水平的ROS可能对活跃的细胞扩张至关重要(图2和图4)。而且，由于GSSG含量的降低而导致的细胞GSH/GSSG比率的显著增加很可能通过调节细胞氧化还原稳态来优化扩张期间的细胞代谢(图4;表S2)。

经HNT处理的水稻植株在夜间会出现轻微的茎部水分不足，不过预计植株水分状况在白天可能会恢复，而且白天水分亏缺的影响比夜间要小。由于技术要求，PicoPPESI-MS分析在白天进行；然而，我们的分析显示，在HNT处理的过程中，白天生长胚胎中糖、尿囊素、谷氨酰胺和乳酸的积累增加(图5，表S2)。在细胞压力探针操作过程中，我们假设探针针尖插入靶细胞后通过部分胞浆空间到达液泡。根据解剖学数据(图2、图S1、图S2)，我们在探针尖端收集的细胞液可以认为是液泡和胞质室的混合物，其中包含细胞器，如线粒体、过氧化物酶体和质体，如下所述。本研究通过对ASC-GSH周期相关代谢物的检测，暗示这些代谢物在细胞中具有丰富的含量。

这暗示种子在低氧状态下可能导致豆科植物乳酸积累和ATP水平下降。本研究未检测到ATP信号本身，可能是由于ATP转换率快和/或细胞内浓度相对较低所致。然而，在HNT中检测到大量乳酸积累(见图5和表S2)表明，与MOE相比，在HNT处理中，BOE可能遇到了更严重的缺氧环境。从观察到的TCA循环相关代谢物的变化(图5)可以看出HNT可能引起呼吸链的抑制或线粒体的某些损伤。这里观察到的乳酸积累量越大，说明HNT条件下发酵的促进作用越大。除乳酸外，检测到的糖还包括Hex、Hex₂（[M+Cl]^-）、pentose、pentose₂（p=0.07）、半胱氨酸（p=0.198）、有机酸（丙酮酸，富马酸，奎尼酸，莽草酸）、亚硫酸和细胞壁相关代谢物（如UDP-Hex和UDP-D-xyl/UDP-L-Ara），这些已在HNT处理的BOE中被检测到，ASC和MDHA的增加是典型的HNT反应，可能优化了细胞氧化还原状态(图4和5，表S2)。

除了在胚胎细胞中检测到GSH/GSSG比值增加外，我们的picoPPESI-MS分析还发现，HNT处理后胚乳中ASC/DHA比值增加。非胁迫条件下，小麦胚乳ASC含量和抗坏血酸过氧化物酶活性的增加可能与延迟程序性细胞死亡(PCD)有关。此外，有研究报道过表达脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)提高ASC和ASC/DHA比值，并可对拟南芥幼苗的热诱导氧化应激起到保护作用。在这项研究中，ASC（和ASC/DHA比率）对胚胎和胚乳发育的确切作用仍然模糊不清，部分原因是缺乏时程分析；然而，应该强调的是，即使在相同的胚乳中，BOE和MOE之间的ASC/DHA比率也存在差异（参见结果）。这种差异可能是指每个区域在成熟前的命运，因为在HNT条件下，BOE和MOE区域在收获前都变成了垩白和半透明(图1和图4)。因此，维持较高的ASC/DHA比值可能是缓解HNT下垩白发生的先决条件。或者，这可能意味着在垩白形成方面存在ASC/DHA比值的阈值。

在玉米胚乳发育过程中，乙烯可能对PCD起调控作用。在玉米中，野生型和sh2 ( sh2 )基因型的胚乳中心均启动PCD，但sh2谷粒的细胞死亡速度和DNA片段化速度快于野生型，表现出较高的乙烯前体、1 -氨基环丙烷- 1 -羧酸( ACC )含量和乙烯生成速率。因此，PCD和ACC之间可能存在相互作用。本研究在水稻同一外胚乳的两个不同位置检测ACC时，细胞间ACC含量没有差异(见表S2中的MOE和BOE)。根据这些数据，乙烯合成可能与靶细胞无关。这表明ACC的相同解释可能不适用于本研究中的水稻胚乳，因此，ASC可能与HNT条件下外胚乳白垩质形成有关，而不是PCD调控。

在水稻和大麦中，有报道称胚乳糖分积累也影响ABA信号，淀粉合成速率的降低可能会打破胚胎休眠，诱导收获前发芽(PHS)。最近，Xu等研究表明，在水稻种子发育后期，PHS9基因可能作为负调控因子参与ABA信号转导。他们还报道了编码CC型谷胱甘肽蛋白之一的PHS9在种子发育后期的胚胎中表达，并在H₂O₂和ABA的诱导下表达。因为谷胱甘肽与控制GSH/GSSG比值的细胞氧化还原稳态密切相关，图4G所示的结果可能是该酶位点特异性激活的结果。此外，这种细胞反应可能与HNT处理的胚胎中可能发生的一些表观遗传修饰密切相关，如下所述。

众所周知，嘌呤分解代谢是在过氧化物酶体中发生的，由尿酸转化为尿囊素的过程中，伴随着H₂O₂的产生。然后，尿囊素通过释放NH₃，转运到内质网(ER)形成乙醛酸盐，供氮再利用。我们还在HNT处理的胚胎细胞中检测到高浓度尿囊素(表S2)。因此，有人认为过氧化物酶体在收集的细胞液中被高度污染，并且尿囊素从过氧化物酶体运输到内质网很可能被抑制，而不消耗内质网通路下游的水分子。此外，至少在所分析的阶段(即11DAH)没有检测到ABA信号，因此尿囊素是否与HNT处理中的ABA反应有关仍存在疑问。然而，类似于ASC和过氧化物酶体中的其他氧化还原相关分子，尿囊素可能在非生物胁迫下充当抗氧化剂。综上所述，HNT下的代谢调控，特别是氧化还原状态和能量状态(发酵和三羧酸循环)在种子内部紧密协调(图1、4和5)。

HNT除了加速胚胎生长外，还同时导致胚乳细胞大小的减小和基底白垩质的形成(见图1和图2)。在垩白形成方面，有证据表明，在类热胁迫条件下，残留在细胞质中的空泡室可能参与了空气空间的形成，导致垩白的形成，同时部分抑制了淀粉(和蛋白质)的积累。线粒体损伤和垩白形成之间可能存在联系，尽管这还有待进一步研究。最近，人们指出了在HDT中白垩形成和胚胎发育之间可能的相互作用，尽管尚未建立任何明确的关系。我们通过显微观察到基部垩白形成主要由空泡室组成，与保存的胞浆空间作用类似。

在DAH的第11天，我们进行了picoPPESI-MS实验，器官分化已经完成，胚胎的生长归因于细胞的增大(见图2K和图6的插图)。值得注意的是，在两种处理中，胚细胞的增大与基底胚乳细胞的间隙(胞质)减小同步(图S6A)。结果分析认为，胚细胞相对膨大率与基部胚乳相对间隙大小减小率相关，呈现明显的筛分(图S6B )。这代表了胚胎生长与垩白形成之间有着密切的关系，正如先前在热诱导垩白形成中提出的。

HNT处理谷粒DW损失约1.5 mg，胚DW增加约0.08 mg(图2A和B)。HNT处理垩白区干重损失约占谷粒总DW的11.02%。如果等量的同化物注入到胚中，白垩系的干物质下降相当于胚胎发育干物质的48.5%(= 0.08/0.165×100)。然而，这个值可能被高估了，因为贮藏在胚乳中的干物质依存度会随着HNT持续时间的延长而变大。由于技术限制，本研究未测定正离子质谱和细胞渗透压。然而，当这里检测到代谢物的累积相对丰度(表S2)作为总溶质浓度估算时，HNT处理后的EMB和BOM细胞的值往往高于对照(图6)。我们认为HNT处理后的胚胎细胞比对照处于更集中的条件下。如果是这样的话，细胞渗透压的增加将诱导水分通过可能的途径从木质部和胚乳细胞优先进入胚内，包括沿中线进入，促进HNT时胚细胞的扩增，从而加速胚的发育(图2)。这就是我们在图6的插图中观察到的。在发育中胚胎附近的胚乳细胞中检测到高浓度的糖和氨基酸支持这一观点(图4，表S2)。由于细胞的水力传导也受到氧化还原状态的影响，在最适ROS浓度下的氧化还原调节可能在水向胚胎的运输中起着中心作用。这种观点认为，如前所述，基底胚乳细胞中储存的胞质(液泡)水可能部分地促进了萌发。

近年来的研究表明，表观遗传修饰在水稻双受精过程中对种子发育起着至关重要的作用。鉴于已知氧化还原状态和谷胱甘肽参与表观遗传修饰，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化和谷胱甘肽化，HNT条件下可能发生一些表观遗传修饰。此外，ROS还参与水稻种子休眠打破和幼苗建立。最近，有人提出激素信号通路参与了与种子萌发相关细胞增殖的ROS调控（存在时间与空间调控作用）。我们通过使用picoPPESI-MS分析胚胎细胞最大扩张阶段BOE的细胞代谢产物(图3 -5)，在HNT-和HDT处理的胚乳(即白背水稻的形成)之间观察到一些相似之处，包括氧化还原调控。我们未检测到GA、ABA等候选激素，然而，这些差异可能是由于阶段的差异，这有待于未来的研究。

图6  HNT条件下发育中的koshikari谷粒的种子发育和胚乳形态事件的示意图。以下是HNT处理11天时在每个部位（胚胎和中胚乳和基生胚乳）观察到的细胞特异性事件和相关主要代谢变化的总结，以红色显示。插图显示溶质浓度估计为负离子模式下检测到的所有信号的累积相对丰度。经t检验，EMB和BOE的处理差异分别为p<0.15和p<0.01（用**表示）。细胞代谢组学（图。3.5）和形态图像分析（见图S6）的数据表明，HNT条件下胚胎发育的加速与基底白垩形成有密切关系。这些器官之间优先的水和溶质运输可能有助于胚胎的快速扩大。

结论

我们利用picoPPESI-MS对发育中的谷粒中HNT处理的代谢反应进行了位点特异性分析。在HNT条件下，胚胎和胚乳的两个部位的细胞水平上已经成功地表征了大量的溶质积累，包括氧化还原相关代谢产物和尿囊素。ASC/DHA比值可能参与HNT处理下垩白的形成。以相对强度为基础的GSH/GSSG比值的细胞测定表明，胚胎生长的加速可能与HNT处理中氧化还原状态的优化密切相关。由于谷胱甘肽氧化状态是缓解休眠的先决条件，因此在HNT条件下，控制胚胎中观察到的最佳氧化还原稳态将导致胚胎生长的加速。如图所示，我们在HNT处理的‘Koshihikari’种子中，使用picoPPESI-MS同时测定GSH/GSSG和ASC/DHA比值。因此，该分析方法也可适用于其他生物样品。在解剖学上，当考虑到水稻种子有相对较大的品种间变异时，对品种差异进行相同的分析可能更具有挑战性。进一步研究包括该方法在内的品种差异，可为水稻应对夜间增温的育种策略提供有用的信息。

原文链接：  

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847221001453

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