科研 | Food Chem.：棕色发酵山羊奶感官特性的代谢组学研究

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编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

发酵和热处理可以改善食品的感官特性。我们采用脂质组学和代谢组学相结合的方法研究发酵棕色山羊奶的化学成分，并探讨化学成分的变化对感官品质的影响。发酵后，棕色山羊奶样品中的有机酸、多肽和中、长链脂肪酸含量显著增加。我们共鉴定出与感官品质相关的108种代谢物和174种脂质。杂环化合物作为美拉德反应的中间体，改变了色、味、香，改变了甘油三酯含量，降低了异味的影响，大大提高了发酵棕色山羊奶的感官品质。本研究为检验山羊奶感官品质提供了新的方法，并深入了解如何对这些品质进行改良，以进一步丰富市场上的乳制品。

论文ID

原名：Integrated metabolomics and lipidomics profiling reveals beneficial changes in sensory quality of brown fermented goat milk译名：综合代谢组学和脂质组学揭示棕色发酵山羊奶感官特性的有益变化
期刊：Food Chemistry
IF：7.514发表时间：2021.06通讯作者：贾玮、石琳
通讯作者单位：陕西科技大学食品与生物工程学院

实验设计

实验结果

1. 酸奶样品的感官特性
我们通过从质地、口感、外观、香气和整体可接受度等方面评估发酵前后棕色样品的感官特性。如图1A所示，发酵后的样品颜色略有加深。发酵前后两个棕色样本的雷达图如图1B所示。发酵前后两个棕色样品的牛奶气味描述与焦糖和咖啡的气味描述相似。两个样品的外观和香气评分相似。发酵样品的口感和整体可接受性评分高于发酵前棕色样品，而质地评分低于发酵前棕色样品。不管是发酵前还是发酵后棕色样品，山羊奶的成分在质地和味道上的得分都很低。羊奶的固体含量为13.2%，脂肪含量为4.5%，蛋白质含量为3.6%，乳糖含量为4.3%，矿物质含量为0.8%，表明羊奶的蛋白质含量略高于牛奶，乳糖含量略低于牛奶。低含量的αs1-酪蛋白是山羊酸奶凝胶形成的原因。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌（德氏乳杆菌乳酸亚种）生产的风味化合物在口感和整体接受度上得分较高，甜味增加，山羊味减少。在糖酵解、蛋白质水解和脂解过程中，热加工和发酵都有助于风味前体的形成。图1 视觉外观（A）、感官评分（B）和靶向代谢组学的定量分析（C）。基于UHPLC-Q-Orbitrap的ESI正离子（D和E）和负离子（G和H）模式的两组和QC样品的PCA评分图，以及ESI正离子（F）和负离子（I）模式中差异代谢物的热图可视化。所有图例中的A代表发酵前的样品，而B代表发酵后的样品。图例中的QC代表质量控制样品。
 2.发酵后的代谢组学分析
我们共鉴定出正离子和负离子模式的代谢物317个和175个(表S1和S2)。主成分分析(PCA)结果显示，两个样本之间有明显的分离，意味着它们的代谢物存在显著差异。如图1D、1E、1G、1H所示，评分图均位于95%置信椭圆内。质控样品得分图聚类程度高表明仪器在数据采集过程中具有较高的准确性和稳定性。前两个主成分(PCs)解释的变异在正向模式中分别为53.1%和8.9%，在负向模式中分别为64.7%和5.1%。与监督方法(PCA)相比，正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)利用正交信号校正滤波器具有更好的判别能力。我们利用R²和Q²估计预测和方差解释比例，建立OPLS-DA模型，均大于0.98，表明拟合度良好。每个分量计算来自OPLS-DA的VIP得分，VIP值> 1和p值< 0.05的代谢物被视为差异显著的物质。我们根据VIP值选取108个差异丰富的代谢物作为潜在感官代谢物，表1列出了排名前20位的代谢物，包括脂类、有机酸类、碳水化合物、多肽和杂环化合物。基于25个差异丰富代谢物VIP值的热图提供了发酵前后棕色样品含量的概览(图1F和1I)。发酵后大部分有机酸和一些杂环化合物增加，使发酵后的样品更具吸引力，这与感官评价相对应。 图2 感官特性的形成过程
 表1 从发酵的棕色山羊奶中分离鉴定出潜在的感官代谢产物（p值<0.05，n=30） 
3.发酵过程中感官特性的形成与美拉德反应的关系
我们选取响应度( > 8.3 E4 )和VIP值( > 1.1 )较高的8种代表性代谢物，包括脂类、有机酸、碳水化合物和杂环化合物进行定量分析(图1C )。除4 -氨基苯甲酸、胞嘧啶和1 -硬脂酰-溶血磷脂酰胆碱外，其他化合物发酵后含量均有所增加。总体而言，D-脯氨酸的含量远高于其他代谢组学，而牛磺鹅去氧胆酸的含量最低。发酵前后棕色样品中D -脯氨酸含量分别为108.96和902.75 mg / L，牛磺鹅去氧胆酸含量分别为0.09和0.37 mg / L。发酵后DL-谷氨酸( 0.82 ~ 13.05mg / L )、鸟嘌呤( 2.01 ~ 65.30mg / L )、L-伊豆醇( 0.67 ~ 7.91 mg/ L )含量增加，但4 -氨基苯甲酸( 9.95 ~ 0.64 mg/ L )、1 -硬脂酰-溶血磷脂酰胆碱( 9.95 ~ 0.64 mg/ L )、胞嘧啶( 31.21 ~ 13.87mg / L )含量降低，这与发酵过程中介体的产生和消耗有关。无论是使用单一的酸奶发酵剂还是共培养的酸奶发酵剂，发酵的主要生化过程都与3个过程的转化有关：1、乳糖经微生物代谢转化为乳酸；2、乳脂被分解成脂肪酸；3、蛋白质(主要是酪蛋白)水解为游离氨基酸和肽。与保加利亚菌或嗜热链球菌单一菌种相比，他们的共生互作可以产生更多的风味相关代谢产物(图2A )。细菌之间的原生质合作通过交换代谢产物而表现出相互促进生长的作用，从而缩短了发酵时间。嗜热链球菌在发酵初期将乳糖分解为乳酸、乙酸、双乙酰、叶酸和甲酸，降低了环境的pH。同时，二氧化碳和脂肪酸能够促进德氏乳杆菌亚种的生长。添加游离氨基酸和多肽的保加利亚乳杆菌能够促进嗜热链球菌的生长。细菌之间的相互作用增加了代谢物的种类和数量，形成了独特的香气和口味的发酵棕色山羊奶。相对较高的羰基化合物、双乙酰、乙脲、丙酮和乙醛的含量使酸奶产生了独特的风味。双乙酰是一种主要的挥发性化合物，有助于感知黄油的香气，并在与乙醛或丙酮反应时传递出一种圆润细腻的黄油味道。乙醛可以通过多种代谢途径获得，使酸奶具有青苹果味或坚果味的感知，而来自柠檬酸代谢途径的酮则提供酸奶的甜味和水果味的感知。我们通过发酵和美拉德反应，获得了一些潜在的感官代谢产物，如加巴沙多、牛磺鹅去氧胆酸和O-β-D-葡萄糖苷反式玉米素(表1 )。熊去氧胆酸是动物胆汁酸的主要生物活性成分之一，在发酵乳制品中尚未见报道。由于牛磺鹅去氧胆酸的特殊结构，它可能是美拉德反应的最终杂环中间体。根据Hodge提出的反应方案，美拉德反应可分为三个阶段：初始阶段，以糖胺缩合形成席夫碱和Amadori重排促进Strecker降解；中间阶段，以糖脱水和裂解为特征，Strecker降解为Strecker醛和氨基酮生成；最后阶段，以醛缩合和黑色素生成为特征(图2B )。类黑精是美拉德反应后期形成的一类棕褐色的、结构复杂的大分子化合物，它在食品中普遍存在。由蛋白质齐聚或带有有色交联结构的游离氨基酸产生的食品黑素可能是精氨酸损失的主要原因。虽然美拉德反应中游离氨基酸，特别是赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸和色氨酸的损失严重，但蛋白质在黑素类着色剂的形成中起着比游离氨基酸更重要的作用。发酵样品中赖氨酸含量降低，这与美拉德反应用量有关。而N-α-乙酰-精氨酸和色氨酸含量增加，说明乙酰精氨酸和色氨酸的损失在一定程度上可以降低(图1F，表S1)。另外，吡咯衍生物等低分子量美拉德反应中间体可以聚合生成高分子量的变色剂，如11 - ( 2 -氧代四氢呋喃基)十一酸和1 - ( 5 - O -膦基- β -呋喃糖基) - 1，2 -二氢嘧啶(表S1 )。在热水溶液中处理可得到理想的深色，为棕色山羊奶提供了较好的感官品质。除了有色化合物外，美拉德反应还生成了3500种挥发性化合物，它们具有棕色牛奶的特色风味，如吡嗪和呋喃。含酮挥发性化合物不仅可以作为美拉德反应的最终产物，还可以作为德尔布鲁氏乳杆菌的发酵产物。虽然一些非挥发性的苦味成分存在于大多数食物基质中，但它们在牛奶和乳制品中很少见，这使得发酵的棕色山羊奶成为一种具有良好感官特性的酸奶。此外，通过过氧化氢酶的转化，乳制品中原本含有的酮类、醛类等风味化合物提高了酸奶的感官品质。我们推测这些杂环中间体的前体物质是在美拉德反应中形成的，经微生物发酵后水解，导致牛磺鹅去氧胆酸和加氧沙啶醇等代谢物出现在褐色和褐色发酵样品中。具体过程有待进一步研究。我们在棕酸奶和棕羊奶中均未检测到丙烯酰胺和5-羟甲基糠醛，这可能与山羊奶中低聚糖含量较高有关。氨基酸催化降解碳水化合物可产生杂环中间体和短链裂解产物，如甲乙二醛和羟甲基糠醛(HMF)，可缩聚或聚合黑素。5-羟甲基糠醛(5- HMF)和丙烯酰胺是常见的食品污染物。研究表明，丙烯酰胺的含量随着添加剂分子量的减小而降低。同时，在较低的pH值下，美拉德反应会受到一定程度的抑制，从而抑制丙烯酰胺的生成。UHT处理的乳制品中未检测到5 - HMF，但在蛋白强化乳和乳糖水解乳中含量较高，我们推测乳制品中5 - HMF含量较低。 图3 (A和B)主要脂质分子种类分布图。ESI正离子(C)和负离子(D)模式下的PCA评分图。ESI正离子(E)和负离子(F)模式下的发酵前后棕色样品和QC样品的PCA评分图。所有图例中的A表示发酵前的样品，B表示发酵后的样品。图例中的QC代表质量控制样品。
 4. 脂质组学分析
一般来说，正模式适合PC、PE、PS、SM检测，而PI在负模式下更容易显示出较高的响应。我们共鉴定出950个脂质分子，其中正离子模式737个，负离子模式213个(表S3和S4)。我们在脂肪酸位置水平上共鉴定出693个脂质分子，可进一步分为19种脂质类型。酸奶样品中主要脂质为TG(55.99%)、PE(8.23%)、Cer(6.49%)、PC(5.63%)、DG(3.90%)、PI(3.75%)、LPC(3.61%)、LPE (3.61%)(图3A)。除PA、LPS、Hex3Cer和LPA等仅存在于发酵后的样品中外，其他脂质基本相似。发酵后，PE和PI变化较大，LPE和LPC变化较小(图3B)。热处理和发酵都能影响油脂种类的组成，尤其是磷脂。除已报道的脂类外，我们还特异地发现了6种脂类，分别为Lyso PA (LPA)、Lyso PG (LPG)、Lyso PI (LPI)、Lyso PS (LPS)、MG和PA，而LPA、LPS和PA只出现在发酵前的样品中。我们采用PCA评分图来可视化两组的分离情况。如图3C和3D所示，各得分点均位于95%置信度椭圆和QC样本重叠处，差异明显(图3E和3F)。前两个主成分( PCs )解释的变异在正模式下分别为45.7 %和18.7 %，在负模式下分别为52.4 %和17 %，VIP值> 1，p值< 0.05，共有174种脂类存在显著差异(图4A )，前20位明显不同的脂类列于表2。为了进一步评估脂质变化，我们完成了定量分析。每个亚类的含量是通过在同一亚类中检测到的所有脂质的总含量来估算的。我们平均各亚类含量后，发酵前棕色样品中PE、PS、PI、LPE、PC、PG、LPC、SM、TG、DG含量分别为0.12、1.01、0.06、0.80、1.49、10.04、164.74、529.93、2795.54、4636.41 μg/mL；在发酵后样品对应含量分别为1.36、25.72、27.01、18.58、7.15、0.53、981.64、599.18、1138.86、2024.78 μg/mL。如图4B所示，发酵样品中PS、PI、LPE含量迅速下降，PG、TG、DG含量上升。脂肪含量以DG最多，其次是TG、SM和LPC。 图4 脂质分子物种在显著不同脂质物种中的分布(A)。两组脂质亚类含量的比较(B)。正(C)和负(D)模式下差异脂质分子的热图可视化。所有图例中的A表示发酵前的样本，B表示发酵后的样本。
 表2 OPLS-DA前20名个体脂质的VIP评分、p值和log₂(FC)(n = 12) 
5. 脂质变化与感官特性的关系
图4C和4D分别显示了正模式和负模式的脂质切面热图图像。PCA结果和聚类分析结果均证实了两组间脂质存在明显差异。发酵前棕色山羊奶饱和脂肪酸含量普遍升高，这与发酵的棕色山羊奶一致。以Cer和Hex2cer为例，虽然发酵样品中Cer的相对丰度增加，如具有不饱和双键的Cer (d16:0 17:1)和Cer (d16:0 19:1)，但Hex2cer的相对丰度明显降低，如Hex2cer (d18:120:0)和Hex2cer (d18:121:0)。脂肪酸可分布成短链(含22种碳脂肪酸)。研究发现，全脂酸奶的感官评分高于低脂酸奶，这可能与全脂酸奶中游离脂肪酸的组成密切相关。游离短链脂肪酸的组成与乳制品的风味特性密切相关。文献报道参与芳香和芳香物质代谢过程的游离脂肪酸，如S-甲基硫代酯的合成，使酸奶具有独特的风味，而有些则会产生不好的风味。短链或中链脂肪酸不仅可以通过水解长链脂肪酸得到，还可以通过降解乳糖和氨基酸得到。羊膻味是由羊乳脂中含有的支链脂肪酸TG水解引起的。这些支链脂肪酸通常由正辛酸壬酸和癸酸与甲基和乙基支链组成。带有支链脂肪酸的甘油三酯被微生物脂肪酶水解，使己酸、丁酸、辛酸、中链游离脂肪酸、短链游离脂肪酸含量增加，从而产生异味感知。然而发酵后棕色样品中含有支链脂肪酸的甘油三酯含量显著高于正常发酵。与发酵前棕色样品相比，发酵样品中TG(8:0 18:218:3)、TG(4:0 16:222:5)、TG(4:0 15:018:2)、TG(6:0 12:118:3)、TG(6:0 8:0 17:1)、TG(11:0 6:018:2)、TG(8:0 10:018:2)和TG(6:0 9:0 18:2)的相对丰度显著增加。由此推测，美拉德反应和发酵，降低了与山羊香气相关的短链游离脂肪酸的含量，从而在一定程度上提高了发酵棕色山羊奶的感官品质，这与感官品质评价是一致的。

结论

总的来说，我们采用代谢组学和脂质组学的方法探讨了发酵后棕色山羊奶的代谢产物和脂质变化，并讨论了代谢产物和脂质变化对感官品质的影响。除了微生物发酵产生的有机酸、脂类、碳水化合物和肽的变化外，杂环化合物也发生了变化。我们共鉴定出492个代谢物和693个脂质化合物，可划分为19种脂质类型；其中鉴定出108个代谢产物和174个脂质化合物为影响棕色山羊乳发酵后感官品质变化的关键感官化合物。杂环化合物不仅使酸奶呈现出棕色，而且还具有特殊的风味，比如焦糖和咖啡的气味。有机酸和TG含量随支链脂肪酸增加而增加，如脯氨酸和TG(6:0 8:0 17:1)，赋予酸奶良好的感官品质。这项研究为检验山羊奶感官品质提供了新的思路，并深入了解如何对这些品质进行改良，以进一步丰富市场上的乳制品。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34153599/

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