科研 | Food Chem：洛神花发酵过程中花青素的变化（国人佳作）

点击蓝字“代谢组metabolome”，轻松关注不迷路

编译：微科盟萌依依，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

在本研究中，作者使用UHPLC-QE-MS 方法结合多变量统计分析研究洛神花酒发酵过程中的代谢特征，尤其是花青素变化特征。作者在发酵过程中鉴定了大量不同的代谢物（例如，酚类、脂类、碳水化合物、氨基酸和肽等）。作者首次在洛神花酒中鉴定出 8 种花青素代谢物，其中在主发酵过程中鉴定出6 种，在后发酵过程中鉴定出2 种。此外，作者确定了发酵过程中的几条代谢途径，洛神花酒中花青素的代谢途径主要与黄酮类生物合成和花青素生物合成有关。这些发现有望用于进一步研究葡萄酒化学和酵母代谢。

论文ID

原名：Using untargeted metabolomics to profile the changes in roselle (Hibiscus sabdariffa L.) anthocyanins during wine fermentation译名：使用非靶向代谢组学分析葡萄酒发酵过程中洛神花（Hibiscus sabdariffa L.）花青素的变化
期刊：Food Chemistry
IF：7.514发表时间：2021.06通讯作者：田灵敏
通讯作者单位：暨南大学

实验设计

实验结果

1. 多元统计分析

在作者的研究中，作者使用先进的UHPLC-QE-MS分析技术来鉴定洛神花酒发酵过程中，包括主发酵期（第 0-12天）、发酵后期（第12-17天）和全发酵过程（第 0-17 天）的潜在生物标志物。首先，作者获得了基峰色谱图(BPC)，它显示了每个光谱在不同发酵时期在正离子和负离子模式下随时间变化的最大强度（补充图 1）。结果表明，不同发酵时间所涉及的代谢物可被明显地分离和区分。为了减少数据维度，提高数据的可解释性和有效性，作者采用了包括PCA和 (O)PLS-DA 模型的多变量统计分析技术，引入到处理后的代谢物列表中进行进一步分析。数据校正后，作者将无监督模式下的PCA模型应用于每个发酵时期的洛神花酒样品。PCA 可以反映样本间和样本内的整体变异性，揭示各种样本之间的分布趋势，并识别可能的离散点。样本在第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）形成的平面上的投影分值即为空间坐标，可以直观地反映样本之间的相似性或差异性。在作者的研究中，每个PCA得分图中的所有样本都落在 95% 置信椭圆内（图 1，A-C）。如图所示，第0天和第12天和第17天、第0天和第17天的发酵样品明显分开，特别是通过第一主成分区分；同时，QC样品在三组中间，紧密聚集（补充图2），表明该实验具有良好的稳定性和重现性。分布结果表明，不同样品间的代谢物存在显著差异，可以有效分离。

通常，样本之间的准确差异无法通过 PCA 算法生成的视觉区分来解释。因此，在目前的工作中，作者通过OPLS-DA 模型实施了监督分类，以监测代谢物随发酵时间的转化程度。OPLS-DA 可以使用多元数据区分两个或多个组（类）。与PLS-DA相比，OPLS-DA可以滤除与分类信息无关的噪声，从而提高分析能力，保证模型的有效性，使模型内组间的差异最大化OPLS-DA多变量方法的得分图如图 1(D-F) 所示。可以看出，OPLS-DA 评分图显示了样品组之间的高度区分，不同发酵组之间有明显的分离。此外，在本次实验中，还检测到优良的模型参数（第 0-12 天：R²Y=1，Q²=0.998；第 12-17 天：R²Y=0.998，Q²=0.846；第 0-17 天：R2Y=1，Q2=0.999）。此外，交叉验证和响应排列测试 (RPT) 表明 OPLS-DA 模型中没有发生过度拟合（补充图 3）。由此可见，OPLS-DA模型是有效的，具有良好的预测能力，表明其可用于区分洛神花酒发酵过程中的代谢差异。

图1 不同发酵周期样品的 PCA 和 OPLS-DA 得分图

A、D，第0天和第12天；B、E，第12天和第17天；C、F，第0天和第17天。

2. 差异标记的确定

OPLS-DA分析中的VIP值被认为是评估组间表达模式差异强度和可解释性的有效参数，较高的VIP值表明变量对分组的贡献较大。通常，VIP值 >1 的代谢物被认为是差异代谢物。此外，还需T检验进一步验证组间代谢物的显著性。由 T 检验得出的p值通常用于评估组间差异的可能性。作者选取OPLS-DA 模型PC1中VIP值>1和p值<0.05为参数，以确定潜在的生物标志物。总体而言，作者在整个发酵过程中鉴定出592种差异代谢物（285种上调和307种下调），其中主要发酵过程中鉴定出583种差异代谢物（282种上调和301种下调），以及在发酵后过程中鉴定出256 种差异代谢物（101个上调和155个下调）（补充表 1）。同时，作者建立了层次聚类分析（HCA）来揭示不同实验样品之间代谢物谱的多样性。如图2所示，横坐标和纵坐标分别代表样品名称和差异代谢物。从绿色到红色的颜色表示代谢物表达丰度从低到高。结果得到的热图显示两个主要簇清楚地分为不同的发酵组（成对比较），表明组间差异标记的强度不同。

图2 在不同发酵时间

A,第 0 天和第 12 天；B,第 12 天和第 17 天；C,第 0 天和第 17 天获得的差异代谢物的树状图和热图。

此外，为了更好地了解发酵洛神花酒主要差异代谢物的变化，作者对VIP标记的主要差异代谢物进行了排序（图3）。如图所示，发酵洛神花酒的主要差异代谢物是酚类、脂质和类脂分子、碳水化合物和碳水化合物结合物、氨基酸和肽、有机杂环化合物、核苷和核苷酸、苯和取代衍生物、有机酸和衍生物、有机氮化合物、醇和生物碱等，这些代谢物在主发酵和后发酵中具有不同的代谢特征。代谢差异主要体现在代谢物的种类和丰度上，与HCA结果一致。在作者的研究中，酚类化合物（例如，黄酮类化合物、芪类和单宁酸）是发酵洛神花酒中含量最丰富的次生代谢物化合物。据报道，酚类化合物对成品酒的整体感官品质（例如风味和口感）有相当大的影响。在这项工作中，酚类化合物，特别是黄酮类化合物，如黄酮苷、异黄酮、黄烷、黄酮、黄酮醇和花青素，是数据库中鉴定出的最丰富的差异代谢物（共134种），可能在洛神花酒质量中起主要作用。花青素是一类主要的黄酮类化合物，是决定葡萄酒颜色的色素，也是葡萄酒药理作用的主要功能成分之一。因此，为了更好地研究洛神花酒发酵过程中花青素谱的主要变化，作者选择了与花青素相关的次生代谢物信号进行下一阶段的分析。

图3 洛神花酒不同发酵阶段主要差异代谢物分析结果

3. 发酵洛神花酒中的花青素代谢物

作者发现与花青素变化相关的VIP标志物（VIP评分>1）见表1，在洛神花酒整个发酵过程中鉴定出8种花青素代谢物。其中，五种花青素代谢物（飞燕草素3,5-二葡糖苷、花青素3-(6''-(E)-caffeylsambubioside）、飞燕草素 3-龙胆二糖苷、天竺葵素 3-lathyroside 和天竺葵素 3-(4'''-p-coumarylrut )-5-葡萄糖苷) 显著上调，而一种(矮牵牛花色素) 显著下调。在后发酵过程中，松香素A显著上调，3-(6''-O-4-苹果酰-葡糖基)-5-葡糖苷显著下调。

飞燕草素3,5-二葡糖苷, 矮牵牛花色素、飞燕草素 3-龙胆二糖苷、飞燕草素 3-(6''-O-4-苹果酰-葡糖基)-5-葡糖苷和松香素A都是飞燕草素型花青素。飞燕草素3,5-二葡糖苷，也称为飞燕草素3,5-O-二葡糖苷，是石榴和海南蒲桃中的主要花青素。在作者的研究中，飞燕草素3,5-二葡糖苷在发酵过程中显著上调，在主发酵过程中增加了2.8×10⁸ 倍，在整个发酵过程中增加了3.4×10⁸ 倍，表明该化合物是洛神花酒中主要的花青素代谢物。矮牵牛花色素是一种常见于植物和葡萄酒中的飞燕草素B环5'-O-甲基化衍生物，已被证明具有良好的抗氧化特性，且对骨骼具有保护作用。作者在研究中发现该化合物在发酵过程中显著减少（0.598倍）。飞燕草素3-龙胆二糖苷属花青素 3-O-葡萄糖苷类，已在乌墨蒲桃果实和玫瑰茄中发现，而飞燕草素 3-(6''-O-4-苹果酰-葡糖基)-5-葡糖苷是转基因康乃馨中基于飞燕草素的花青素的主要形式之一。然而，像飞燕草素 3,5-二葡糖苷一样，这些花青素都没有在果酒中报道过。此外，松香素A，也称为二甲花翠3-O-咖啡酰葡萄糖苷，是红葡萄酒中发现的一种吡喃花青素，尤其存在于Pinotage（南非最具特色的酿酒葡萄品种）葡萄酒中。松香素A似乎是由二甲花翠素-3-葡糖苷和咖啡酸反应产生的稳定产物，据报道它仅在老化过程中形成。作者在研究中发现该化合物显著上调（2.0915倍），这与之前的研究部分不一致。花青色素3-(6''-(E)-caffeylsambubioside是一种在Benalu Batu (海棠属)中发现的花青素型花青素。在作者的研究中, 花青素3-(6''-(E)-caffeylsambubioside在整个发酵过程中显著上调（136.92 倍），仅次于飞燕草素3,5-二葡糖苷。此外，两种天竺葵素型花青素（天竺葵素3-lathyroside 和天竺葵3-(4'''-p-coumarylrutinoside)-5-葡萄糖苷)也在洛神花酒中首次被检测到。 

图4 差异代谢物途径的富集分析

A,第 0 天第 12 天；B,第 12 天第 17 天；第 0 天第 17 天。颜色代表 p 值，气泡代表差异代谢物的富集数。

事实上，葡萄酒浸渍和发酵有助于从水果中提取花青素。同时，在酿酒、储存和陈酿过程中，花青素的成分可能会进一步改变，从而导致葡萄酒的感官品质发生变化，包括色、香、味和口感。本研究首次在洛神花酒中检测到上述所有花青素。葡萄酒浸渍过程主要发生在发酵的早期阶段，有助于将洛神花中的花青素释放到葡萄酒中。在不同发酵阶段鉴定的花青素代谢物表现出不同的结构（图 5）、VIP 值和 FC（表 1）：一方面，花青素是质子化的水溶性分子，对许多因素敏感，如不同的 pH 值、温度、氧气、光和酶，由于葡萄酒发酵是一个复杂的生化过程，发酵系统环境条件的变化可能会导致不同的花青素谱；另一方面，葡萄酒的花青素谱与不同类型分子有关，这可以通过酿酒技术和年份条件进行修改。例如，在酿酒过程中，由于酵母吸附分子的损失，葡萄汁的花青素成分可能会发生变化。洛神花花萼中的主要花青素化合物，如飞燕草素-3-桑布双糖苷或/和花青素-3-桑布双糖苷，在发酵洛神花酒中未被鉴定为差异代谢物。这归因于花青素和一些中间代谢产物的小分子在发酵过程中可能经过一系列生化反应形成了新的天然花青素衍生物；因此，发酵洛神花酒中的花青素多以聚合花青素的形式存在。

图5 洛神花葡萄酒中与花青素相关的假设代谢途径

4. 花青素代谢途径分析

代谢物通路富集分析是阐明不同实验样品代谢改变机制的有效工具。作者基于KEGG数据库分析了不同代谢物的代谢途径富集。在整个发酵过程中，作者共鉴定出154条代谢途径，涉及99 种不同的代谢物（补充表2）。这些代谢物主要是脂类、核苷和核苷酸、酚类、有机杂环化合物、碳水化合物、氨基酸和肽，以及有机酸及其衍生物。同样，作者在主发酵过程中确定了 145 条代谢途径，在后发酵过程中确定了75条，分别涉及100和48种不同的代谢物（补充表2）。作者为了更直观地比较不同发酵阶段代谢途径的差异，保留前20条差异代谢途径进行富集分析（图4）。如图所示，整个发酵过程显示出与主发酵过程相似的代谢途径，主要有 ABC 转运蛋白、FoxO 信号通路、嘧啶和嘌呤代谢、味觉转导等。然而，发酵后的代谢途径主要是胆汁分泌，利什曼病和C型凝集素受体信号通路相关的路径等。

作者在洛神花酿酒过程中发现了两种与花青素相关的代谢途径（标记物飞燕草素和飞燕草素3,5-二葡糖苷），包括类黄酮生物合成 (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?ko00941/ko:C00389blue/ko:C05908%09red/ko:C09826%09red/ko:C10107%09blue/ko:C10434%09blue) 和花青素生物合成 (https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?ko00942/ko: C05908 红色/ko:C 16312%09red)；然而，尚未确定与其它花青素有关的代谢途径。据作者所知，花青素生物合成起源于苯丙烷生物合成。简而言之，苯丙氨酸通过苯丙烷生物合成途径产生肉桂酰辅酶A；然后，肉桂酰辅酶A通过黄酮类生物合成途径代谢产生各种花青素（例如天竺葵素、花青素和飞燕草素）；最后，通过花青素生物合成途径产生各种次生花青素代谢物，洛神花发酵酒中与花青素相关的假设代谢途径如图5所示。

在酿酒过程中，多种酶参与代谢并产生不同的次级代谢产物。例如，参与黄酮类合成途径的与花青素相关的常见酶是黄烷酮3-羟化酶、黄酮类 3'-羟化酶和类黄酮3',5-羟化酶，它们与花青素和飞燕草素的衍生相关。由于苯基中的羟基数目不同，花色素通常被各种花色素合成酶分为不同的类型（主要是天竺葵素型、花青素型和飞燕草素型），例如UDP-葡萄糖：花色3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）可以催化UDP-葡萄糖的葡萄糖基部分转移到花色素的3-羟基上，产生第一个稳定的花色素苷，如天竺葵素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷和飞燕草素3-O-葡萄糖苷，这些花青素可进一步作为3位鼠李糖基化、5位葡萄糖基化和3位糖残基酰化的底物。在本研究中，花青素生物合成过程中，飞燕草素在 3GT 催化下产生飞燕草素3-O-葡萄糖苷，然后在花青素3-O-葡萄糖苷 5-O-葡萄糖基转移酶的催化下代谢产生飞燕草素 ,5-二葡萄糖苷和花青素3-O-葡萄糖苷5-O-葡萄糖基转移酶。然而，参与其他花青素代谢的酶和底物尚不清楚。

表1 花青素标记在不同发酵阶段具有最强的识别潜力

RT:保留时间;VIP:组中的重要性值;FC:倍数变化值

花青素的代谢过程复杂，会产生多种次生代谢产物。虽然黄酮类生物合成和花青素生物合成是已知的花青素代谢途径，但作者研究中发现的这些花青素代谢物的具体代谢机制仍未完全了解。因此，未来的研究仍应致力于为发酵洛神花酒中的花青素建立标准化的代谢指纹。

结论

在本研究中，作者采用先进的分析技术—UHPLC-QE-MS—研究了洛神花酒发酵过程中的代谢变化，尤其是花青素的代谢变化，他使用 PCA、OPLS-DA 和 HCA 模型分析发酵第 0、12 和 17 天的样品。非靶向代谢组学结果突出了不同发酵阶段产生的代谢物的显著差异，主要是在代谢物类型和丰度方面。综上所述，洛神花酒发酵过程中鉴定出大量差异代谢物，主要包括酚类、脂质和类脂分子、碳水化合物和碳水化合物结合物、氨基酸和肽、有机杂环化合物、核苷和核苷酸等。在花青素代谢方面，6 种花青素次生代谢产物（1.飞燕草素3,5-二葡糖苷、2. 花青素3-(6''-(E)-caffeylsambubioside）、3.飞燕草素3-龙胆二糖苷、4.天竺葵素3-lathyroside、5.天竺葵素3-(4'''-p-coumarylrut )-5-葡萄糖苷),和 6.矮牵牛花色素)在主要发酵过程中被鉴定出来，2个（1.松香素A 和 2.飞燕草素3-(6''-O-4-苹果酰-葡糖基)-5-葡糖苷)在后发酵过程中被鉴定出来，本研究也证明了洛神花酒中花青素的代谢主要发生在主发酵过程中。整个酿酒过程共鉴定出154条代谢途径，其中黄酮类生物合成和花青素生物合成是主要的花青素途径。本研究详细介绍了洛神花酒发酵过程中主要代谢产物和花青素的变化，为进一步研究葡萄酒发酵和酵母代谢奠定了基础。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34242878/

----------微科盟精彩文章---------- 

----------微科盟更多推荐---------- 

免费生信作图平台——生科云
	长按左侧二维码  进入生科云
生科云所有分析工具可以免费使用，不收取任何直接或间接费用；您还可以在微信上联系微生态老师，随时获取免费的指导，帮助您解决分析时遇到的问题；专业的生信分析团队，持续添加、更新、优化生信云上的分析工具，集成多种生信分析流程，一键批量生成主流科研图，帮您节省时间，有更多的时间探究生物学意义。

如果需要原文pdf，请扫描文末二维码

代谢组metabolome期待与您交流更多代谢组学问题

（联系代谢组学老师即可申请入群）

请关注下方名片

了解更多代谢组学知识