Nature Genetics|lncRNA测序新策略（重大突破）

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iNature：基因及其转录本的准确注释是基因组学的基础，但是目前还没有注释技术将高通量测序和准确性结合起来。因此，参考基因的收集仍然不完整 - 许多基因模型是片段化的，还有数以千计的未被注释的转录本，特别是对于长的非编码RNA （lncRNA）。为了加速lncRNA注释，GENCODE联盟开发了RNA捕获长序列（CLS）的方法，将靶向RNA捕获和第三代长读测序相结合。在这里Johnson等人提出了GENCODE基因间lncRNA群体，在匹配的人类和小鼠组织中的重新再鉴定，分别发现了3,574和561个新转录本。 CLS大约是目标基因座标注的复杂度的两倍，优于现有的短读技术。由CLS产生的全长转录物模型使我们能够明确地阐述lncRNA的基因组特征，包括启动子和基因结构以及蛋白质编码潜力。因此，CLS消除了转录组注释中长期存在的瓶颈。

LncRNA代表了哺乳动物基因组中广泛且相对未开发的组分。 lncRNA功能的分配取决于高质量转录组注释的可用性。目前这样的注释还很简单：我们对lncRNAs的总数没有多少了解，对于已经确定的那些，结构大体上还是不完整的，对于进一步研究功能，存在很大的瓶颈。

lncRNAs作用

使用不同方法的项目有助于增加可用lncRNA注释的数量和大小。通过FANTOM cDNA测序工作和公共数据库【1,2】得到了早期基因组与通过染色质特征，并鉴定了长基因间非编码RNA（lincRNA）【3】。最近，研究人员已经应用转录本重构软件，如Cufflinks【4】，在短读RNA测序（RNA-seq）数据集中鉴定新基因【5-9】。然而，lncRNA的标准参考文献目前是定期更新来自GENCODE的手动注释，这些注释是基于cDNAs的管理，并大部分来自表达序列标签【10,11】，并已被国际基因组学会所采用【12-15】。

lncRNAs典型例子

目前，注释工作面临高通量和质量之间的必要折衷。基于短读的转录组重构方法提供大量的注释，而且在资源和时间上投资较低，而手动注释较慢，需要长期的资金资助。然而，由于从较短的序列读取重建转录本结构的固有困难，软件重构的注释的质量通常是可疑的。这种结构往往是不完整的，往往缺乏相邻外显子之间的末端外显子或剪接点【16】。这尤其影响lncRNAs，其低表达导致读取覆盖率低【11】。结果是在质量不确定的大型自动化注释（例如，NONCODE【8】的101,700个基因）和使用“保守”策略的GENCODE集合【11】（25,757个基因）之间分歧越来越大。

方法流程

注释不完整有两种形式。首先，基因可能完全从注释中缺失;许多基因组区域被怀疑转录RNA，但不包含注释，包括推测长前体【17】，增强子【18】和超保守元件【19,20】及“孤儿”小RNA。其次，注释的lncRNA可能代表部分基因结构。最初，发展了一种快速扩增cDNA末端，然后测序（RACE-seq）的方法来完成lncRNA注释，其中，尽管通量相对较低【21】。

CLS方法产生长读的转录组数据

lncRNA注释的主要障碍之一是它们的低表达水平【3,11】。为了克服这个问题，RNA捕获测序（CaptureSeq）【22】被用来提高cDNA文库中低丰度转录物的浓度。 这样的研究取决于短读取测序和计算机转录本重建【22-24】。因此，虽然CaptureSeq达到高通量，但其转录本结构缺乏包含在GENCODE中所需的置信度。

lncRNA基因结构

在本文中，Johnson等人描述了一种新的方法，即CLS，它将目标RNA捕获与第三代长读cDNA测序相结合。 使用CLS在6个人类组织和6个小鼠组织中去检测基因间lncRNA的GENCODE目录，以及数千个疑似新基因座。 另外证明CLS将CaptureSeq的高通量与长读取测序的高置信度，完整转录模型相结合，从而在转录组注释中取得进展。

lncRNA全长转录本注释

全长注释提供了迄今为止对lncRNA基因性质最可靠的观点。 LncRNAs比以前认为的剪接长度和外显子数更接近于mRNA。Johnson等人注意到启动子的类似趋势：当lncRNA启动子被CLS准确定位并与表达匹配的蛋白质编码基因比较时，发现它们在激活修饰方面令人惊讶地相似。这意味着以前的研究应该重新评估TSS的注释。另一方面，lncRNA启动子确实具有独特的性质，包括抑制性组蛋白修饰水平的富集，招募Polycomb组蛋白以及与绝缘子蛋白CTCF相互作用。据作者所知，这是第一个提出lncRNAs和绝缘子元件之间关系的报告。总体而言，这些结果表明，在表达差异归一化之后，lncRNA基因特征本身通常与mRNA类似。

lncRNA全长转录本特征

尽管成功地绘制了注解lncRNAs中的新颖结构，但是同时作者也观察到的惊人的低数目的转录模型，来源于对较少的未注释基因座相数目，包括超保守元件和增强子。这表明至少在此处测序的组织样品中，这样的元件不会产生大量的lncRNA样聚腺苷酸转录物。

潜在的新的lncRNA全长转录本鉴定

总之，通过解决lncRNA转录本注释中长期存在的障碍，CLS方法有望加速进展到最终的“完整”哺乳动物转录组注释。这些更新的lncRNA目录代表了基因组和生物医学界的宝贵资源，并解决了lncRNA生物学的基本问题。

原文链接

https://www.nature.com/ng/journal/vaop/ncurrent/full/ng.3988.html

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参考文献

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