宏基因组测序（mNGS）：病原微生物诊断新风口
文 l 文研 最近三十年，组学研究一直是热点，最早火起来的是基因组学，然后是蛋白质组学，如今最有前途的新兴组学领域是宏基因组学（metagenomics），而宏基因组测序（mNGS）描述了样本中存在的所有DNA或RNA信息，从而能够分析整个微生物组以及患者样本中的人类宿主基因组或转录组，让致病微生物无所遁形。病原微生物宏基因组测序国外代表公司有IDbyDNA、Karius，国内代表公司有华大基因、迅敏康、微远基因、予果生物/微码生物、金域检验、深圳谱元、华点云、金匙基因、赛哲生物、碳云智能、杰毅生物等。mNGS将在诊断、监测和跟踪新的疾病暴发方面发挥关键作用，从而挽救生命并降低控制成本。
这是漫投简史的第 9 期分享。
作者 l 文研
来源 l 漫投简史（ID：metallur）
人类和其他动植物每时每刻都生活在微生物的海洋中，仅在人类身体中，就包含了数目约为人类细胞10倍之多的微生物细胞！当中包括病毒、细菌、真菌及其他微生物。这些独特的微生物“客人”有安静沉默的，有打闹破坏的（病原体），也有善良有益的。为了分辨不同的微生物以揭示其与人体的“关系”，宏基因组学（Metagenomics）被应用于临床微生物诊断！
宏基因组学与宏基因组测序
宏基因组学（Metagenomics）概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是“meta-”，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为“应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株”的科学 [1]。
最近三十年，组学研究一直是热点，最早是基因组学，然后是蛋白质组学，如今新兴组学领域则是被认为最有前景的宏基因组学（Metagenomics）。宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学，通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA或RNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成、群落功能，并可开发新的生理活性物质（或获得新基因）。
随着基因测序技术的迅猛发展，基于二代测序的宏基因组学（宏基因组测序）成为了临床的焦点。宏基因组测序（mNGS）是综合分析来自患者样本的微生物和宿主的基因物质（DNA和RNA）的方法，应用于多种感染性疾病的诊断、疾病和健康状态下微生物学分析、人类宿主反应对感染传播的特征化、识别肿瘤相关病毒。
mNGS病原微生物诊断新风口
2014年新英格兰医学杂志报道了一个通过宏基因组辅助检测治愈了一位原因不明、反复发热、具有癫痫及脑积水症状的14岁男孩的案例，这是历史上首个宏基因组临床应用成功的案例。文章报道这个常规治疗及病原筛查都没有确诊原因，随后对脑脊液样本mNGS筛查，结合生物信息学分析结果发现一种可疑的致病菌 leptospira infection，随后针对性地使用万古霉素和头孢吡肟治疗后出院。该团队确认这是一种尚未报道过的病原微生物[2]。由此，临床宏基因组正式应用于微生物诊断拉开了帷幕。
来自Wilson, N Engl J Med 2014, 370: 2408-2417
微生物包括细菌、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体以及病毒，它们个体微小、种类繁多、与人类关系密切。涵盖了有益跟有害的众多种类，广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。临床微生物学的范畴包括微生物诊断学和临床样本的病原学识别，以指导感染性疾病患者的管理和治疗策略，以及公共卫生微生物学、社区感染性疾病报告的监督和监测。
传统微生物诊断的方法是体液培养检测和药敏试验，但阳性率仅为10%左右；PCR检测在敏感性、特异性和检测时效上明显优于培养法，但因为该法基于已知病原菌的基因组序列，所能提供的信息有限，依然不能解决临床诊断阳性率低的问题；除此之外，对于混合感染和未知致病微生物的检测是传统检测方法无法逾越的障碍。所以传统检测虽然提供了相当经济有效且快速（通常少于2小时的检测时间）的方法，但是只限于诊断已知的最常见的感染。临床检测方法的局限常常导致错误用药和延误治疗，故此尽快发展新的能满足临床需求的检测方法刻不容缓。
临床宏基因组测序与传统方法指标对比
高通量测序技术的发展和组学技术的兴起为发展新的检测技术提供了新的可行途径和思路，宏基因组测序（mNGS）描述了样本中存在的所有DNA或RNA信息，从而能够分析整个微生物组以及患者样本中的人类宿主基因组或转录组，让致病微生物无所遁形。2001年，Fields在Science上发表的一片论文形象的将mNGS和传统检测方法做了对比，如下图所示[3]。
来自Fields, Science. 2001, 291, 5507: 1221-1224
宏基因组测序以无需纯化培养、能够快速全面的展示序列信息的优势，逐步在临床上开枝散叶。2016年美国FDA认可用二代测序技术进行微生物鉴定及耐药毒力分析；2019年病原宏基因组学被写入成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南；2019年复旦大学附属中山医院的胡必杰团队研究结果显示，mNGS具有更高的病原体鉴定灵敏度，受抗生素的影响较小，因此具有检测传染疾病的潜力及临床意义 ，其结果发表自世界著名学术期刊 Clinical Infectious diseases上[4]；2019年中华急诊医学杂志发表《宏基因组诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》。
目前病原微生物宏基因组测序公司还不多，国外代表公司有IDbyDNA、Karius，国内代表公司有华大基因、迅敏康、微远基因、予果生物/微码生物、金域检验、深圳谱元、华点云、金匙基因、赛哲生物、碳云智能、杰毅生物等。
mNGS病原微生物诊断市场概况
目前美国感染类疾病的诊断市场总规模为180亿美金，预计在2022年基于mNGS的感染类疾病诊断市场将达到50亿美元。
根据IMS公司的数据，每年中国使用抗生素的住院患者达到1.16亿人，其中尚不包括接受抗真菌和抗病毒治疗的患者。在我国感染性疾病的发病率为120-250人/10万人，死亡人数为3.38人/10万人,占总死亡率的1.2%，农村的发病率高于城市。微生物送检量约5000万份，其中血培养约4000万例/年，肺泡灌洗液BALF约100万例/年，脑脊液及其他体液约50万例/年。另外，随着肿瘤患者生存期显著增长，超过30%肿瘤患者死于复杂感染。基于以上数据，当检测价格降至2000-2500元区间，目标市场检测量保守估计为500万份/年，约为100亿人民币。
展 望
尽管在通往光明的路上，为临床提供一站式解决方案仍然艰辛，但是mNGS必将成为临床诊断的有力工具。mNGS将在诊断、监测和跟踪新的疾病暴发方面发挥关键作用，从而挽救生命并降低医疗成本。
引用文献
[1] Itai Sharon and Jillian F. Banfi eld. Genomes from Metagenomics. Science, 2013,, 342: 1057-1058.
[2] Wilson, MR, Naccache, SN, Samayoa, E, Biagtan, M, Bashir, H, Yu, G, Salamat, SM, Somasekar, S, Federman, et al. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing. N Engl J Med. 2014, 370: 2408-2417.
[3] Fields, S. PROTEOMICS: Proteomics in Genomeland. Science. 2001, 291, 5507: 1221-1224.
[4] Miao, Q., Ma, Y., Wang, Q., Pan, J., Zhang, Y., Jin, W., et al. Microbiological Diagnostic Performance of Metagenomic Next-generation Sequencing When Applied to Clinical Practice. Clinical Infectious Diseases. 2018, 67(suppl_2), S231–S240.
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