凌波微课|扩增子研究第十讲：扩增子测序中的物种组成分析

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扩增子测序中的物种组成分析 

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我是主讲人Bonnie 今天我们给大家分享的内容来自公众号“红皇后学术”，主题为：

扩增子测序中的物种组成分析

在上一讲中，我们对扩增子测序的基本信息统计进行了介绍，这一讲中，主要介绍的是16S rRNA基因扩增子测序结果的物种组成分析。

在扩增子测序结果中，用于展示样本中细菌群落组成情况的形式有很多种，venn图、群落结构组分图、聚类图、Heatmap图、系统发育树等都能很好的展示物种组成，下面我们将一一为大家讲述不同展示方法的差异。

首先我们来看看韦恩图，韦恩图可以比较直观的表现样本的OTU数目组成相似性及重叠情况。在文章中，通常用于展示多个样本中所共有和特有的OTU数目，例如下面这张图，展示了水稻根不同区域的细菌组成，揭示了根际微生物组可能是由根际、根表和根内逐步建立起来；韦恩图还可以用来对共有的细菌进行比较，例如在2015年发表的植物人工重组菌群文章，研究了水杨酸对微生物组的影响。韦恩图在写文章时，可以用并排排列的方式进行展示，便于比较和发现特定的规律。

文章中使用最多的还是物种组成丰度条形图，主要是用来解释样本中主要的物种是什么，以及各类微生物的相对丰度。为了作图效果，一般会将丰度小于1%的类群合并作为other展示。在文章中除了展示相对丰度较高的优势物种以外，还可以展示特定分类学水平，如门、纲、目、科、属水平对应的物种组成。

一般在写文章的时候可以用门水平和属水平的两幅图相结合，门水平来解释样本中主要包含哪几个门，这几个门丰度水平如何，根据样本分组给出一个概括性的物种丰度变化规律。之后使用属水平或其他较低分类学水平注释的结果，来表示主要的门由什么物种组成，其变化规律主要是由于组成其的物种中哪些物种的变化导致的。

需要注意的是，大部分环境样本在属水平得到注释的OTU比例是比较低的，如果老师对于分辨率有较高的要求，可以选择全长16s扩增子分析，感兴趣的老师可参考我们之前的微课《微生物组多样性研究新热门——16S rDNA全长扩增子测序》，了解全长扩增子测序技术。

群落结构组分图还可以结合组间连线，比如下面这幅图，这里堆叠柱状图每个微生物门类之间都通过曲线连接，在有限的微生物堆叠柱状图中可以更加清晰的观察不同处理对应的微生物门类的丰度大小变化；同时还可以结合差异性检验结果，如果把差异性检验的结果在图像中标出，比如在Water一列的前三个门上标上星号，表示这3个门在水中的丰度显著高于沉积物，看起来是不是更加清晰呢。

样本聚类树与柱状图组合分析也是比较常见的，左侧是基于bray-curtis算法构建的相似度树状图，样本之间的差异越小，样本便会处在相近的同一分支上；右侧是样本的群落结构柱状图，展示样本中微生物的群落结构。既可反映样本或分组间的相似性，又能展示样本内的元素组成信息。

由于物种组成丰度条形图展示物种数目的限制，当我们有很多物种丰度都不是特别高的时候，尤其是再展示低分类学水平的结果，比如属水平物种丰度的时候，物种组成丰度条形图就不是特别合适。

这时候就需要用到物种丰度聚类热图，根据需要将数据进行物种或样本间丰度相似性聚类，将聚类后数据表示在heatmap图上，可将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。

在热图的绘制过程中，涉及到一个标准化的问题，左边的图就是没有进行标准化，右边的图是进行了标准化。

没有标准化就是按照物种本身的丰度进行绘图，从左侧的图可以看出，这种方式可以很明显的区分不同物种的丰度差异，但是当物种丰度在不同样本间差别不是很大的时候，或者或不同物种丰度比较离散的情况下，比如单一物种丰度最高能够达到10%，而最低却只有0.1%，这时不同样本间物种丰度的差异就很难被看出来。

标准化就能够对物种分度数据进行转换，将丰度水平不同的物种标准化到同一个比例标尺中，从而能够更好的展示低丰度物种在不同样本间的差异。但是这种方式要特别注意，标准化后只有同一行具有可比性，同一列的不同物种间是没有可比性的，比如说如在这幅图中，如果说同一个样本中红色的物种比蓝色的物种丰度高，那就错了。

在物种组成分析结果中，目前常见的还有两种展示方式，core microbiome分析和优势物种群落结构组分图。

Core microbiome分析的原理是根据OTU在各样本中的丰度，找到在不同阈值条件下样本中存在的core microbiome，并绘制core microbiome曲线，可以直观的看到组间的核心微生物。优势物种群落结构组分图是通过选取单个或者所有样品丰度最高的一些物种绘制柱状图并显示该物种对应的门水平分类信息，同一颜色物种表示来源于同一门类。

除了以上这些展示物种组成的方式外，也有用系统发育树进行展示的，系统发育树是用聚类到OTU的代表序列构建的，由于环境样本中聚类到OTU的数目非常多，通常会展示丰度排名前50-100的OTU，系统发育树可以表示这些OTU的分类学位置，展示的方法也多种多样，通过不同的颜色来代表属于统一高级分类学水平的OTU，有些系统发育树还会结合物种的相对丰度信息。系统发育树真正用在文章里的情况还是比较少的。

在物种组成分析的结果中，目前常见的还有两种可交互式的结果展示方式，结果展示十分直观，查找也很方便，一般用来对数据结果进行初步的观察，以确定后续的分析思路和结果是否需要进行调整，不过这类结果一般很少出现在文章中。

其中一个是krona的物种组成圈图，其以一个环形图的形式表示样本的物种组成，环形从里到外一次为门至属水平的物种组成，每一个物种所匹配的扇形区域代表其丰度，并且直接标出了物种的并称及其相对丰度。

另一种就是经典的QIIME分析自带的交互式丰度结果，主要是用来查找主要物种相对丰度的具体数值，以及在样本中的平均丰度。

还有一种并不太常用的结果图，物种分类学系统组成树，可以将主要物种的丰度与其分类学位置相结合。在图像中不同原点的连接代表其所属的分类学关系，原点的大小代表其相对丰度，这一图像的优势是可以明确主要物种的系统发育关系，和我刚才所讲的通过门和属水平来解释物种组成变化规律其实比较类似。

由于这一结果一般会作到属水平，而大多数样本中，几个主要的属是很难代表样本的整体微生物群落的，所以在使用的时候还是要根据具体情况来考虑。

今天的分享就介绍到这里~感谢来自“红皇后学术”的内容分享。玩转科研就来凌波微课，我们下期见！

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