Cell：苏士成团队揭示补体调控肿瘤B细胞双向作用机制丨CellPress对话科学家
B细胞是肿瘤微环境的重要组成部分。既往多项重要研究发现，B细胞具有促进肿瘤发生发展的作用[1-4]。但近期，越来越多的证据表明B细胞在抗肿瘤免疫的产生中有着至关重要的作用。有临床研究发现针对B细胞的利妥昔单抗在实体瘤患者中没有显著疗效；另外，今年有文章报道，大型队列研究结果显示B细胞浸润和免疫治疗的效果呈正相关。因此，何种B细胞促进抗肿瘤免疫、B细胞扮演促癌或抗癌角色的未知决定因素是目前该领域亟待解决的重要问题。
2020年3月5日，中山大学苏士成研究员团队在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell（《细胞》）在线发表题为“Complement Signals Determine Opposite Effects of B Cells in Chemotherapy-Induced Immunity”的研究论文。
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该研究发现，乳腺癌化疗后三级淋巴样结构中一群ICOSL+ B细胞对抗肿瘤免疫产生起到关键作用。补体调节蛋白CD55调控了该群细胞的产生，进而决定肿瘤B细胞起到免疫促进还是免疫抑制的作用。（图1）
图 1 该课题的研究思路
1. 单细胞测序解析化疗前后B细胞动态表型
新辅助治疗是针对未发现远处转移的乳腺癌患者，在计划的手术治疗之前进行的全身系统治疗，具有缩小肿瘤有利手术、判断药敏及时换药、评估预后等优势。中山大学孙逸仙纪念医院是国内最早开展乳腺癌新辅助治疗的中心之一。在长期的临床观察中，该团队发现这种治疗策略除了为患者带来临床获益外，还能通过对比治疗前的确诊穿刺标本，和治疗后的手术切除标本，精确观察同个病人在治疗前后，肿瘤免疫微环境的动态改变[5-7]。
为了解读B细胞在化疗后的改变，作者分别收集了四例乳腺癌患者在新辅助化疗前后的肿瘤标本，从中分离了998和1499个肿瘤浸润B细胞并进行单细胞测序（图 2）。同时，通过流式分析对另外79例的标本进行了验证，最终发现在化疗前占很大比例的表达IL-10的B细胞，在化疗后显著减少，取而代之的是一群以ICOSL+CR2highIL-10-CD20+CD38+CD27+IgA-IgD-为特征的B细胞。以上结果提示治疗效果好的患者化疗后的肿瘤浸润B细胞发生了表型转换。
图 2 化疗前后配对乳腺癌标本中的B细胞图谱
2. 全视野数字化切片扫描及自动化分析揭示B细胞亚群在三级淋巴样结构中分布
免疫组化或荧光染色、计数是组织研究的常用手段，然而，既往研究中实验者手动拍摄数个视野、计算细胞表达情况的方法存在诸多弊端。除了手动拍摄带来的组织遗漏问题，人为操作还会造成一定的分析偏倚。
在该研究中，作者应用了全视野数字化切片扫描系统和自动化分析软件，发现在新辅助化疗后的肿瘤组织中，ICOSL+B细胞的数目与患者的化疗反应性正相关（图 3）。更有意义的是，接受过新辅助化疗的患者，尤其是三阴性乳腺癌患者中，ICOSL+B细胞的浸润数目与长期生存时间正相关。全视野切片扫描的结果还带来了另外一个新奇的发现，这群ICOSL+B细胞比起ICOSL-B细胞更倾向于定位在化疗后形成的三级淋巴样结构中，并且与T细胞直接接触。以上结果提示该群B细胞在肿瘤局部淋巴样结构的运行中承担重要职责，可以作为判断化疗诱导的抗肿瘤免疫反应、患者疗效及预后的重要指标。
图 3 全视野扫描及自动化分析探索B细胞亚群的临床意义
3. B细胞条件基因修饰小鼠揭示靶向治疗意义
研究ICOSL+B细胞功能的首要前提是确定ICOSL的细胞特异性。针对髓系细胞表达ICOSL、滤泡树突状细胞表达CR2的情况，作者利用cas9技术，通过重组酶系统（Cre-loxP）分别建立了特异性敲除B细胞表达ICOSL和CR2的条件敲除小鼠。借助该模型，作者发现了ICOSL+B细胞产生及发挥功能的机制：肿瘤细胞在化疗药处理后，表面外翻的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine， PS）能够引发补体C3活化进而通过CR2激活B细胞，使得B细胞表达ICOSL，诱导CD4+和CD8+T细胞分别向辅助T细胞（Th1）及细胞毒性T细胞（CTL）分化，从而促进抗肿瘤免疫。
最后，作者还发现并非全部乳腺癌细胞系都能够在体外共培养体系中诱导ICOSL+B细胞产生，通过分析细胞系数据库，筛选发现这一现象与细胞系表达CD55的高低相关。CD55是一种表达于细胞膜上的补体抑制蛋白，能够通过灭活C3转化酶抑制补体C3活性片段的产生。在乳腺癌患者中，肿瘤组织CD55的表达量与ICOSL+B细胞的数目呈负相关，靶向CD55能促进化疗后ICOSL+B细胞和抗肿瘤免疫的产生。
4. 总结
研究团队应用上述研究模型，对化疗前后的肿瘤相关B细胞进行了表型和功能的探索。最终发现化疗后肿瘤微环境中，一群新的B细胞通过表达ICOSL激活T细胞的抗肿瘤功能；该群细胞产生的机制是化疗后肿瘤细胞免疫原性死亡引发的补体激活，而补体调节蛋白CD55在肿瘤中的表达决定了不同肿瘤中B细胞所呈现的相反的作用。
苏士成研究员的博士后陆艺文、赵绮毅副研究员、廖建友副研究员为共同第一作者。宋尔卫院士为本课题的设计给予了宝贵的意见。
Cell Press细胞出版社微信公众号特别邀请苏士成研究员代表团队接受了专访，请他进一步为大家深入解读。
作者专访
Cell Press： 该研究发现乳腺癌化疗后三级淋巴样结构中一群ICOSL+ B细胞对抗肿瘤免疫产生起到关键作用。研究开展期间是否遇到一些困难，您和您的团队是如何攻克它们的？
苏士成研究员：我们在15年开始这项课题。当时查阅文献发现有多项重要研究显示B细胞起到免疫抑制和促进肿瘤耐药的作用。的确，我们看到术前化疗效果差的患者标本中有大量B细胞浸润。但是，在术前化疗后肿瘤细胞完全消失的标本中，我们也看到大量B细胞浸润，而且与T细胞密切接触形成一种类似淋巴组织的结构。我们就感到比较困惑：如果B细胞是促癌的话，为什么完全缓解的标本里会有这么多B细胞？
碰巧当时单细胞测序技术在国内开始普及，我们医学研究中心平台的廖建友副研究员在生物信息分析这方面有很好的经验。也非常感谢浙江大学郭国骥教授等这方面的专家对我们的技术问题做了耐心的解答。另外在临床标本分离免疫细胞方面我们之前也有一定积累。因此，我们通过单细胞测序技术对比术前化疗前后乳腺癌中B细胞的表型，发现B细胞的分群在治疗前后会发生显著变化。
其中一群化疗后显著增多的ICOSL+B细胞亚群引起我们的注意：1）James Allison团队在临床试验标本分析中发现肿瘤浸润ICOS+T细胞是CTLA4单抗治疗响应的重要标志。2）既往报道肿瘤组织中的ICOSL主要由髓系细胞表达，B细胞ICOSL在肿瘤免疫中的作用并不清楚。因此，我们运用B细胞条件敲除小鼠，发现ICOSL+B细胞在乳腺癌中起到了促进T细胞抗肿瘤免疫的作用，进一步发现补体信号调控该群细胞的产生。
另外，我们在分析乳腺癌患者的肿瘤组织切片时发现，传统的手动拍摄切片视野在准确定位肿瘤区域内B细胞上有很大困难，并且人工计数存在不可忽视的操作者误差。为了解决这个问题，我们运用全视野扫描的显微镜拍摄整个组织，并将扫描结果通过自动化计数软件进行分析，最终统计得出了数百例乳腺癌组织切片中ICOSL+B细胞的分布，不仅验证了在化疗后ICOSL+B细胞增多，也发现了这群B细胞在分布上的特点，就是多位于三级淋巴样结构。
碰巧的是在我们文章原则接收的同时，Nature期刊上有三篇同时发表的文章显示B细胞和三级淋巴样结构对多个类型的肿瘤病人术前治疗有重要预测作用。我们的研究对细化这类免疫组织细胞的临床标注物和阐明其潜在分子机制有一定意义。
Cell Press：本项研究发现，新辅助化疗后的肿瘤组织中，ICOSL+ B细胞的数目与患者的化疗反应性正相关。能否请您谈一谈本项研究对于新辅助化疗临床治疗的意义。
苏士成研究员：目前新辅助化疗在乳腺癌患者中的应用越来越广泛。新辅助化疗能让肿瘤缩小，分期降低，使得一些肿瘤较大的患者获得手术机会；另外能判断预后和药敏，能指导调整治疗方案。但同时，一部分病人对新辅助化疗的反应较差，先化疗反而会延误手术时间，甚至可能造成疾病进展。因此，预测患者对新辅助化疗的反应能够避免无效的治疗，对提高乳腺癌患者的治疗疗效有重大的意义。
我们发现化疗后出现的ICOSL+B细胞能够激发抗肿瘤免疫，进一步辅助增强化疗的疗效，补体信号调控该群细胞的产生。而在制约ICOSL+B细胞产生的一个关键因素，是肿瘤组织表达的补体抑制蛋白CD55。我们的分析数据也显示化疗前穿刺癌组织高表达CD55的患者，往往对新辅助化疗的反应较差。所以通过筛查乳腺癌患者诊断时的穿刺组织中CD55的表达水平和B细胞的数目表型，也许可以预测患者未来对化疗的反应如何，成为临床医生制定个体化治疗方案的一个依据。当然，这还需要大规模临床研究的分析和验证。
Cell Press：能否请您谈一谈您的团队下一步的研究方向。
苏士成研究员：我们团队主要的研究方向是如何防治乳腺癌复发转移，尤其是免疫治疗的价值与应用。肿瘤免疫治疗领域的研究者获得了诺贝尔奖，肿瘤免疫治疗的手段和适应症也越来越多。然而肿瘤免疫治疗目前在临床上的应用还是很有限，只适用于一小部分病人，关键就在于大多肿瘤缺乏免疫靶点表达。我们现在的研究提示，肿瘤中免疫靶点的表达是随着治疗等因素动态变化的，对于免疫靶点无表达的患者，通过免疫治疗能够改善靶点的表达情况，辅助增强常规治疗的疗效，并且可以借助免疫细胞的标记物特性，及早预测患者对治疗的反应。下一步，我们团队将继续深入研究治疗过程中肿瘤中免疫细胞的特征改变及在临床上的应用价值，例如前面所说的，通过某些分子标记物预测治疗适用人群，找到相关的影响靶点并进行干预，拓宽免疫治疗的应用范围。
Cell Press：对于那些青年医生来说，该如何平衡临床与科研?您有何心得体会可以与大家分享？
苏士成研究员：首先我要感谢中山大学和孙逸仙纪念医院，为我们开展科研的临床医生提供了有力的支撑平台和配套条件。另外我有许多优秀的榜样，我的研究生导师宋尔卫教授和科主任刘强教授在临床与科研都做得十分出色。同样重要的是我们科室是一个非常团结的集体，同事在手术时间安排和病人管理等方面给予我非常大的支持。
论文通讯作者介绍
关于 苏士成 研究员
研究员，副主任医师，博士生导师。中山大学孙逸仙纪念医院乳腺癌研究中心主任，乳腺肿瘤医学部副主任，中山医学院免疫教研室副主任。兼任中国抗癌协会青年理事会常务理事、免疫代谢学组副组长、肿瘤转移专业委员会委员。主要研究兴趣是乳腺癌免疫治疗新靶点的发现和应用。成果以通讯作者（含共同）在Cell、Nature Immunology、NatureCell Biology、Nature Communications、ClinicalCancer Research、Cancer Research等期刊发表。主持国家自然科学基金优秀青年、国家自然科学基金重大研究计划集成项目、长江青年学者、国家重点研发计划青年专项等项目。获得“求是杰出青年学者奖”、首届生物技术创新大会“优秀青年科学家”等奖项。被授予共青团中央 “全国青年岗位能手”、广州医师协会“广州市实力中青年医生”、“羊城青年好医生”等称号。指导学生获得“第五届全国大学生基础医学设计大赛一等奖”等奖项。
本文参考文献（上下划动查看）
1 Shalapour, S. et al. Inflammation-induced IgA+ cells dismantle anti-liver cancer immunity. Nature 551, 340-345, doi:10.1038/nature24302 (2017).
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4 Ren, Z., Peng, H. & Fu, Y. X. PD-1 Shapes B Cells as Evildoers in the Tumor Microenvironment. Cancer Discov 6, 477-478, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-0307 (2016).
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相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文
论文标题：
Complement Signals Determine Opposite Effects of B Cells in Chemotherapy-Induced Immunity
论文网址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30159-8
DOI:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.015
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