首款靶向GPCR的纳米抗体用于治疗动脉粥样硬化的临床研究

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动脉粥样硬化

是一种慢性血管疾病，其主要特征是动脉内壁逐渐沉积胆固醇、脂质和钙等物质，形成斑块，逐渐导致血管狭窄和硬化。这可能会限制血液流动，增加心血管事件（如心脏病发作和中风）的风险。

根据《2017 年全球疾病负担研究》，心血管疾病是导致全球死亡的主要原因，估计每年有 1780 万人死亡。动脉粥样硬化是一种慢性病理现象，其中炎症是该疾病进展的主要驱动力之一，已被公认为心血管疾病的主要病因。

根据  统计，截至目前，全球共有490个药物，来自366个机构，覆盖193个靶点，开展3670个临床试验。

动脉粥样硬化的发病机制包括内皮细胞损伤、脂质沉积、炎症反应和平滑肌细胞增殖等过程。

内皮细胞损伤导致血管壁通透性增加，脂质沉积在血管壁形成斑块，引发炎症反应。炎症反应进一步激活免疫细胞和血小板，释放炎症介质和生长因子，促进平滑肌细胞增殖和斑块形成。最终，斑块破裂导致血栓形成，引发心脑血管事件。

动脉粥样硬化斑块的免疫事件，来源于 DOI: 10.1038/ni.2001

尽管过去的三十年，越来越多的研究证据表明，免疫成分在动脉粥样硬化的形成和慢性化过程中发挥着不可或缺的作用，并通过一系列的免疫治疗靶点，证明了针对心血管疾病中的炎症和免疫系统所带来的益处和挑战。

来源于 DOI: 10.1038/s41569-021-00668-4

通过靶向免疫调节因子开发靶向治疗动脉粥样硬化的首个候选抗体药物是人源化单克隆抗体 Plozalizumab，这是由  开发的靶向的拮抗型单克隆抗体。CCR2 在单核细胞和巨噬细胞向炎症部位的迁移过程中发挥着重要作用，巨噬细胞被招募到动脉壁被认为是动脉粥样硬化发展的关键步骤。

第一个纳米抗体候选药物是靶向  受体的 。

靶向CX3CR1 的纳米抗体

趋化因子及其受体在与动脉粥样硬化有关的慢性炎症反应中发挥着重要而复杂的作用。

在动脉粥样硬化的起始阶段，白细胞动员和招募到活化的内皮导致动脉内皮功能障碍。例如，表达于白细胞  可与表达在内皮细胞上的膜结合型 CX3CL1 结合，激活淋巴细胞，导致淋巴颗粒释放，从而损伤内皮。

来源于，DOI: 10.3390/jcm10173825

2020年1月， 与 团队在《单克隆抗体》杂志撰文，报道了一款靶向趋化因子受体 CX3CR1 的 VHH 抗体 ，可抑制动脉粥样硬化的进展。  是一种强效的 CX3CR1 生物治疗拮抗剂。

为了鉴定 CX3CR1 的 VHH 拮抗剂，研究人员使用多种策略和免疫原对骆驼进行了免疫。第一组骆驼首先用编码 CX3CR1 DNA 免疫，随后使用4轮次过表达人类 CX3CR1 的 Caki 细胞系进行加强免疫。第二组骆驼首先使用过表达人类 CX3CR1 的 Caki 细胞系免疫，然后用牛血清白蛋白（BSA）佐剂对来自 CX3CR1 细胞外环的多肽进行四次强化免疫。

用 FACS 分析免疫动物的血清滴度，来源于DOI: 10.1080/19420862.2019.1709322

从动物体内分离出外周血单核细胞和淋巴结，并将其用于构建噬菌体 VHH 文库的 mRNA 来源。与 CX3CR1 结合的 VHHs 是通过两种不同的筛选策略获得：(1) 在过表达人 CX3CR1 的 Ba/F3 和 CHO-K1 细胞系上进行交替筛选，或使用过表达 CX3CR1 的病毒样颗粒（VLP）进行多轮筛选。

通过使用荧光标记的趋化因子作为流式分析工具，研究人员评估了不同的VHHs 对荧光标记的趋化因子的竞争效果。

随后，研究人员通过在两个VHH 之间添加一段 35 个 Gly-Ser 的连接片段构建了二价 VHH，用以提高 VHHs 的结合效力。在大肠杆菌中表达的四种二价 VHH，它们与表达人 CX3CR1 的 Ba/F3 细胞的结合能100% 阻断荧光标记的天然趋化因子，IC50 值小于 1 nM。

随后，研究人员对亲代野生型美洲驼 VHH 进行人源化改造，得到了与人类 VH3-JH 种系共识序列更为一致的 VHH 序列，对以下氨基酸：E1D、S11L、A14P、E16G、R44Q、D46E、A74S、K83R 和 Q108L 进行了研究和评估，以确认蛋白质的结构、活性和稳定性保持不变。

因为，单个可变结构域的 VHHs 通常半衰期很短，为了实现需要长期用药的新治疗理念，研究人员将序列人源化优化的 VHH 分别与白蛋白结合型 VHH（BI-655088）或人 lgG1 Fc 结构域（BI-655089）融合。改造后的BI-655088 或BI-655089 具有较好的活性。由于 BI-655088 的 PK 曲线较优，因此被选为进一步分析的最佳候选药物。

BI-655088 是一种新型的高选择性生物治疗剂，加入他汀类药物等标准治疗方法后，可减少动脉粥样硬化斑块中的炎症，从而显著减少现有心血管疾病患者的动脉粥样硬化血栓事件。

2016年，Boehringer Ingelheim 启动了关于 BI-655088 在健康男性志愿者中的临床1期研究，“健康男性受试者静脉输注单剂量 BI-655088 的安全性、耐受性、药代动力学和药效学（单盲、剂量组内部分随机、安慰剂对照、平行组设计）”。

该研究中，分别评估了安慰剂 2mg、6mg、20mg、50mg、100mg、200mg BI-655088 的安全性，其中仅200 mg 组出线较严重的副反应，研究结果于2023年1月更新于www.clinicaltrials.gov/。

BI-655088 是否有机会成为第一款靶向GPCR 类靶点的纳米抗体类药物，GPCR3D 将持续关注。

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