新格元创始人重磅成果 |《Science》颠覆性技术：Spatial-CUT&Tag, 高分辨率的空间表观遗传学技术
人类基因组是一本包含约32亿个DNA碱基对的“无字天书”，超过98%是非蛋白质编码序列，被科学家比喻为“基因组中的暗物质”，这些基因组序列虽不直接参与蛋白质的编码，但与基因的表达及调控息息相关，通过染色质状态影响基因组功能，开放的染色质可与启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件和反式作用因子结合，且其在不同细胞类型中可被动态调节。
为了进一步揭示染色质特性，了解表观遗传学作用机制，人类不断开发新的研究技术，从Chip-seq到染色质内源切割ChEC（chromatin endogenous cleavage）和染色质免疫切割ChIC（chromatin immunocleavage）技术[1]，再到2017年的CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）和2019年被应用于单细胞研究的CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术[2] [3]，表观遗传学研究技术的精准度和分辨率都日益精进。2021年Anoop P. Patel团队和Gonçalo Castelo-Branco、Marek Bartosovic等研究人员将高通量单细胞技术与CUT&Tag技术结合，分析复杂组织中单个细胞的组蛋白修饰和转录因子情况，取得了研究的突破性进展[4] [5]。近年来，单细胞层面空间技术成为了关注的热点，帮助研究人员探究细胞在整个组织景观中的定位及物理互作。然而，单细胞表观基因组数据中的空间信息尚未可知，这将是研究人员亟待解决的新的挑战。
继2020年11月14日在国际顶级期刊《Cell》上描述了一种基于微流体条码标记的空间多组学测序(DBiT-seq)技术后，2022年2月10日，新格元联合创始人耶鲁大学樊荣教授团队又在国际顶级研究期刊《Science》上发表文章《Spatial-CUT&Tag: Spatially resolved chromatin modification profiling at the cellular level》，开发了一项研究单细胞空间表观基因组的新技术——Spatial-CUT&Tag，并利用该技术解析小鼠胚胎和大脑的空间染色质状态，揭示了组织类型特异性表观遗传学调控，并提供空间信息，为研究正常生理学和发病机制中的表观遗传调节、细胞功能和命运决定提供新的工具[6]。
1. Spatial-CUT&Tag基本原理及实验步骤
该技术实验主要包含以下几个步骤：首先，用甲醛将冷冻组织切片固定在标准胺化玻璃载玻片上，然后将目标组蛋白修饰的抗体添加到固定的组织切片中，再添加二抗用以增强pA-Tn5转座子的结合力。随后，通过添加Mg2+缓冲液激活转座子，使包含连接器1的adapter被插入到基因组DNA的组蛋白标记抗体识别位点。接下来将一组DNA条形码溶液通过微通道引入组织切片，对adapter进行原位连接，获得一个独特的空间条形码Ai（i=1-50）。然后再将第二组条形码Bj（j=1-50）以与第一个条形码微通道垂直的方向引入组织切片，两组条形码在交叉点连接起来，形成一个组织切片的2D网格，每个网格都包含一个独特的条形码Ai和Bj组合，用以表征位置信息。接下来对组织切片进行成像，将组织形态与空间表观基因组图谱进行关联。最后通过反向交联收集DNA片段，完成文库构建及测序。
2. Spatial-CUT&Tag性能评估
为了检测spatial-CUT&Tag的性能，研究人员利用spatial-CUT&Tag技术检测了E11小鼠胚胎样本H3K27me3（抑制位点）、H3K4me3（激活启动子）和H3K27ac（激活增强子和/或启动子）的分布情况。在50μm分辨率的组织2D网格中获得了9788（H3K27me3）、16135（H3K4me3）或24663（H3K27ac）的特异性片段，其中16%（H3K27me3）、67%（H3K4me3）或16%（H3K27ac）片段落在峰值区域内，具有较高的基因组覆盖率和低背景水平。进一步检测了20μm分辨率下的同类信息，并与同样测序深度的小鼠大脑的scCUT&Tag技术数据进行比较，得到了很好的验证，表明spatial-CUT&Tag不仅提供了空间表观遗传信息，而且具有很好的性能和数据质量。
3. 小鼠胚胎的spatial-CUT&Tag分析
在确定了测序数据质量后，研究人员通过染色质状态来区分不同的细胞类型，将分群的结果映射回原有的空间位置，确定了与H&E染色相邻组织切片相一致的空间分布模式。具体表现为：Cluster 1（H3K27me3）和Cluster 6（H3K4me3）对应心脏；Cluster 2（H3K27me3和H3K4me3）和Cluster 4（H3K27ac）对应肝脏；Cluster 8（H3K27me3）、Cluster 3（H3K4me3）和Cluster 1（H3K27ac）对应前脑；Cluster 9（H3K27me3）、Cluster 5（H3K4me3）和Cluster 3（H3K27ac）对应脑干；Cluster 11（H3K27me3）、Cluster 8（H3K4me3）和Cluster 2（H3K27ac）对应中枢神经系统（CNS）的后部区域，如脊髓。进一步将特定器官的ChIP-seq数据映射到细胞分群UMAP图上，数据匹配度良好，有效区分E11小鼠胚胎中的主要细胞类型。上述结果表明，spatial-CUT&Tag能够以高空间分辨率解析主要组织结构。
为了确定发育过程中的空间修饰模式，研究人员检测了E11小鼠胚胎样本组蛋白修饰不同细胞类型特异性标记基因的活性及空间定位。如Hand2是血管发育所必需的，在心脏形态发生中起着至关重要的作用，通过计算染色质沉默分数（CSS），发现由于心脏中缺少H3K27me3抑制标记，Hand2基因的CSS较低，活性高。以及Nfe2对调节红系和造血细胞的成熟和分化至关重要，使用基因活性评分（GAS）评估，发现由于肝脏和心脏的H3K4me3和H3K27ac激活标记富集，Nfe2基因的GAS较高，活性高。为了预测增强子及其靶基因细胞簇的基因调控相互作用，将候选增强子的scRNA-seq和H3K27ac修饰的基因表达相关联。基于相关性的图谱成功地预测了一些增强子-基因的相互作用，且得到VISTA验证。
接下来，研究人员将scRNA-seq数据和spatial-CUT&Tag数据相结合进行分析，结果显示空间组织信息能够很好地与scRNA-seq数据的分群进行匹配。对检测到的几种器官特异性细胞类型在两组数据中进行了映射验证，发现作用于早期胚胎红系发育的红细胞只在肝脏中富集；心肌细胞仅在心脏区域观察到；软骨细胞和成骨细胞在胚胎面突中广泛存在；抑制性中间神经元在脑干中高度富集；在脊髓区广泛观察到有丝分裂后的早熟神经元，这些结果都与解剖学注释高度一致，表明单细胞转录组数据与空间表观组学整合能够对细胞类型进行更加准确的定义，并可得到不同细胞类型染色质修饰状态的空间分布信息。
研究人员还通过将组织切片的spatial-CUT&Tag和免疫荧光染色结果相结合，进一步证实了spatial-CUT&Tag数据的准确性。首先用核DNA染料DAPI对小鼠嗅球组织切片染色，然后进行20μm分辨率下H3K27me3抗体的spatial-CUT&Tag分析，区分出主要细胞类型，包括肾小球层（cluster 1）和颗粒层（cluster 2），并且spatial-CUT&Tag得到的H3K27me3修饰模式和免疫荧光染色结果一致，并且通过选择DAPI染色结果中感兴趣的区域，可以在不分离组织的情况下提取原位单细胞表观基因组数据。
4. 小鼠大脑的spatial-CUT&Tag分析
研究人员还对P21小鼠大脑切片进行了类似的20μm分辨率下的spatial-CUT&Tag技术分析，结果同样表明了spatial-CUT&Tag可以高分辨率解析主要组织结构，且scRNA-seq数据与空间表观组学能够很好的整合分析，从而对小鼠大脑细胞类型进行更精确的定义，并揭示染色质修饰状态的空间分布信息。
综上所述，该研究表明spatial-CUT&Tag以高分辨率揭示了原位组织切片组蛋白修饰图谱，并通过结合DBiT-seq方法和spatial-CUT&Tag数据，实现了空间多组学分析，证明了微流控条形码方法与转录组和蛋白质等其他分析结合的可行性。
Spatial-CUT&Tag将单个细胞的表观基因组、转录组和蛋白质组提升到空间层面，基于二代测序，对组织环境下的表观遗传学机制的全基因组图谱中进行无偏倚的分析，该方法可进一步通过使用蛇形微流控通道或增加条形码数量，增加映射区域，对研究分化发育和疾病机制有着重大意义，并为空间生物学增加了新的维度。
参考文献
[1] Schmid, M., Durussel, T., and Laemmli, U.K. (2004). ChIC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell, 16, 147-157.
[2] Skene, P.J., Henikoff, J.G., and Henikoff, S. (2018). Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols, 13, 1006-1019.
[3] Kaya-Okur, H.S., Wu, S.J., Codomo, C.A., Pledger, E.S., Bryson, T.D., Henikoff, J.G., Ahmad, K., and Henikoff, S. (2019). CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications, 10, 1930.
[4] Bartosovic, M., Kabbe, M., and Castelo-Branco, G. (2021). Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology, 39, 825-835.
[5] Wu, S.J., Furlan, S.N., Mihalas, A.B., Kaya-Okur, H.S., Feroze, A.H., Emerson, S.N., Zheng, Y., Carson, K., Cimino, P.J., Keene, C.D., et al. (2021). Single-cell CUT&Tag analysis of chromatin modifications in differentiation and tumor progression. Nature Biotechnology, 39, 819-824.
[6] Yanxiang, D., Marek, B., Petra, K., Di, Z., Yang, L., Graham, S., Archibald, E., Zhiliang, B., Castelo-Branco, G., Rong F. (2022). Spatial-CUT&Tag: Spatially resolved chromatin modification profiling at the cellular level. Science, 375（6581），681-686.
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