【RNA 和cDNA】测序完整转录本 - 发育中的橄榄果蝇胚胎的转录动力学

橄榄果蝇（Bactrocera oleae）是橄榄树栽培最重要的害虫之一，每年造成约 8 亿美元的损失。橄榄果蝇是一种二倍体生物，具有跨越6对染色体、大于 470 Mb的基因组，其中包括一对异染色质性染色体，雄性为异配性别。已知性别决定在胚胎发育的前6小时内开始，但发育中胚胎的转录动力学尚未被探索，雄性决定因素仍有待理解。

为了研究发育中橄榄果蝇胚胎的转录组，Anthony Bayega及其同事使用MinION对来自混合性别胚胎的poly-A+ RNA进行了全长cDNA测序，这些胚胎在发育的前 6 小时中被每小时收集一次（图 1）。该实验利用Oxford Nanopore长读长技术测序完整转录本的能力，目的在于对发育中的胚胎进行转录组分析，并将转录组信息与美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的当前基因模型进行比较。

图1. 从样本采集到测序的实验过程示意图

使用SQK-PCS108 cDNA-PCR测序试剂盒，在MinION设备上使用R9.4测序芯片进行测序，获得总共 3100 万条读长（每个时间点中位数为 420 万条读长）。Anthony是新型SQK-PCS109 PCR-cDNA试剂盒的早期开发人员，他发现该试剂盒提供了更简单的工作流程和两倍的测序产出，证明 PCS109 试剂盒对于未来的转录组研究的潜在益处。

超过 50% 的表达基因具有至少一条全长读长。选择包含 5’端接头、poly-A+尾和 3’端接头的读长来聚焦于全长转录本。将此方法得到的序列与短读技术产生的序列进行比较，表明检测相同数量的基因，此方法所需的读长要少40倍。
 
从头转录组组装识别出3553个新基因、8330个与NCBI预测匹配的基因、以及总共79810个转录本。总体而言，与NCBI预测的转录组相比，转录组多样性增加了四倍。此外，用该数据集还校正了在NCBI中错误建模的38个基因。
 

通过在cDNA合成阶段加入RNA标准（ERCC）确定绝对转录本数值，随后使用这些数值生成标准曲线，用来后续将每个胚胎转录本丰度的相对读长数转换为绝对读长数。该定量方法已经过qPCR检测对基因表达进行验证。

绝对转录本数量的定量被用于探索母体-合子转变，这一过程之前尚未在橄榄果蝇中进行过研究，但已在与之密切相关的双翅目黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中得到了研究。在此转变期间，发育中的胚胎中大部分母体转录物本蛋白质被清除，并且诱导合子转录。在果蝇属（Drosophila）胚胎中，母体转录本在发育的前3小时内失去稳定性，并且合子转录在第2小时被激活。与之相似，Bayega 等人发现，每个胚胎的转录本总数在发育的第1小时和第2小时之间下降到一半；而与第2小时的水平相比，第3小时增加了143%。
 

利用从成年雄性和雌性橄榄果蝇头部获得的长读长序列，研究人员得以进一步探索性别决定所涉及的基因异构体的复杂性。在一些基因中，如double sex（dsx）和transformer（tra）这两个决定性别的主调控因子中，可能出现各种各样的选择性剪接事件。 dsx的异构体复杂性在胚胎和成虫组织之间显著不同；较长的异构体在胚胎发育早期最为突出，而成虫脑中较短的异构体更为普遍。特别值得注意的是，包含外显子4的情况仅在成年雌性组织中观察到。

详细内容，请观看以下视频了解：

了解性别决定背后的机制是揭示可能的遗传控制机会的重要一环。例如，在实验室中针对dsx的CRISPR-Cas9靶向编辑实现了冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的种群抑制。类似的方法可以用于标靶不存在于雄性橄榄果蝇中的 dsx 外显子 4，从而用于橄榄果蝇的遗传控制。
 
该研究首次提供了关于橄榄果蝇胚胎转录组复杂性的信息，并展示了更好地理解性别决定在控制对经济有严重影响的农业害虫种群数量中具有的潜力。

References:

1. A. Bayega et al. Transcriptome landscape of the developing olive fruit fly embryo delineated by Oxford Nanopore long-read RNA-Seq. BioRxiv (2018). DOI: http://dx.doi.org/10.1101/478172

2. A. Bayega. Transcriptome landscape of the developing a olive fruit fly embryo delineated by Oxford Nanopore long-read RNA-Seq. Available at: 

https://nanoporetech.com/resource-centre/anthony-bayega-transcriptome-landscape-developing-olive-fruit-fly-embryo-delineated [Accessed 15 January 2019]

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