【精彩回顾】使用纳米孔cDNA测序来揭示人脑中临床相关的mRNA选择性剪接的复杂性

London Calling 2019

使用纳米孔cDNA测序来揭示人脑中临床相关的mRNA选择性剪接的复杂性

Nicola Hall，牛津大学精神病学系

Nicola Hall是Tunbridge小组在牛津大学精神病学系的博士后研究员。她利用自己在分子生物学和RNA测序方面的背景来研究人类大脑中的基因表达。

钙离子信号传导对神经传导至关重要，在心血管系统中也很重要，电压门钙离子控通道与编码该蛋白的CACNA1C基因与包括双相情感障碍和精神分裂症在内的精神疾病有着密切的联系。Nicola表示她感兴趣的是“基因剪接”，对大脑基因剪接的研究揭示了基因以及整个大脑是如何运作的，并有助于精神疾病的研究。

Nicola Hall及研究团队从3个受试者中分别各取6个人脑区域的样品进行实验，提取RNA后进行逆转录，并利用MinION测序仪对cDNA进行长读长测序。

他们首先进行了外显子水平分析，结果显示大脑中CACNA1C剪接比以前已知的更加多样化：包括 38种新外显子，7种已知的先前注释过的亚型和83种可信度高的新亚型。发现的10个最丰富的亚型中有9个是新的，且有8个被预测有编码功能。在不同的大脑样本中检测到的亚型成分分析图表明，大脑不同区域之间的剪接变异比个体之间的差异更大，这个结果赋予了未来的潜在治疗希望，并表明剪接是根据细胞类型和功能进行调节的。

他们接着分析了剪接位点，识别剪切位点的连接处，并将这些剪接位点的序列进行对比。此方法可以检测小规模变异，他们检测出了195个高可信度的转录本，其中只有3个是已经注释过的。结果再次表明，CACNA1C的剪接多样性远高于预期，并且大脑不同区域之间的差异比个体之间的差异更大。

结果还显示了拼接事件中的许多“共同点”——即经常出现在同一区域，但很少出现在对结构至关重要的区域中，这表明该过程不是完全随机的。这个分析能够检测小到一个氨基酸密码子的变异，并且检测到的一些变异相当丰富——在几乎一半的样本中都能看到一个。

Nicola提到另一个问题，有没有其他形式的转录组变异？有一种可能是源自可变起始位点。他们利用5'RACE（cDNA末端的快速扩增） 分析鉴定出了人脑中的两个转录起始位点：一个是已知的，一个目前未注释过。未注释过的转录起始位点预测编码一个具有截断N末端的功能性通道。研究团队以小鼠为样本，检测心脏样本中不存在的大脑特定区域的亚型，又发现了剪接亚型的“巨大多样性“，其中许多是新亚型，数据显示小鼠心脏和大脑中的亚型间有明显的差异，这表明“剪接似乎是具有很强的组织特异性的”。

Nicola最后总结到，人类CACNA1C基因编码各种新型的CaV1.2通道。在小鼠中，大脑和心脏的CACNA1C基因编码不同的亚型，这说明该基因可能成为鉴定脑特地亚型的潜在靶点。研究团队目前正在表征人大脑和心脏CACNA1C的亚型并进行功能分析，以了解检测到的剪接如何影响蛋白质功能。

更多纳米孔测序的应用如甲基化、结构变异、人类X染色体端到端测序组装等大会精彩内容，请见我们后续London Calling 2019 - Day 2的分享。

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