【精彩回顾】London Calling 2019——Day 2 研究精彩集锦

London Calling 2019 第二天，不一样的内容，一样的精彩，今天为大家节选了人类X染色体端到端组装，甲基化和cfDNA超灵敏检测的精彩演讲。

Karen Miga 加州大学圣克鲁兹分校

Karen Miga领导完成了首个完整组装的人类Y染色体。致力于结合创新的计算和实验方法来生成高分辨率人类着丝粒和着丝粒周围区 DNA序列图。

London Calling 2019

端粒到端粒组装完整的人类X染色体

以遗传学和基因组学进入了一个要求完整的、高质量基因组组装的“新纪元”作为演讲的开场，Karen介绍了一个超越人类参考基因组GRCh38连续性的全基因组从头组装，以及首个完整的、端粒到端粒的人类X染色体组装。

首个人类基因组的组装是一项标志性的成就，在经历了近20年的不断提升后，现有的人类参考基因组（GRCh38）是当前最准确和完整的脊椎动物基因组。然而它并不是完整的，仍有368个未解的问题和102个缺口，并且尚且没有一个染色体是从头至尾完成的。例如，第21号染色体有大约30Mb的组装序列，却有约20Mb的缺失序列，这些尚未能够被探索的区域有可能与疾病相关联。这些“问题区域”包含了分段重复、基因家族、卫星阵列、着丝粒和rDNA，以及人群中未被鉴定的序列变异。

Karen的目标是完成这些剩余区域，生成第一个真正完整的人类基因组。

生成完整组装最大的挑战，是跨越着丝粒上那些可以长达几百Kb、甚至是Mb的重复区域。那么高覆盖度、超长读长序列能不能用来解析这些区域，来完整人类基因组的组装呢？Karen表示，她所在的端粒到端粒联盟小组（Telomere-to-Telomere，T2T）成立的动力，是推进最高质量的基因组学的标准。

从2018年5月到2019年1月，Karen和她的同事利用长读长纳米孔技术，共使用94张MinION/GridION 测序芯片来测序CHM13细胞系。获得50x深度的基因组覆盖度，比对定位后的最长读长为1.04Mb。结合其它测序平台的长读长数据，这些超长的纳米孔读长被用于建立contig并进行处理(polish)和结构验证，使用比对软件Canu进行测序组装，最终获得的组装大小为2.94Gb, contig N50为75Mb。超越了contig NG50为56 Mb的人类参考基因组GRCh38完整性和连续性。

Karen表示，下一步是使用这种混合从头组装法来组装完整的人类X染色体。X染色体与许多孟德尔疾病有关，因而值得投入时间进行研究。组装X染色体最大挑战的在于着丝粒，这需要能够跨越100kb异常重复区域的超长纳米孔读长。对于如何polish组装并达到高精确度，Karen创建了使用独特k-mers的polish策略：这首先涉及到识别整个基因组中所有独特的单拷贝k-mers。接着这些k-mers被用于建立scaffold，作为高度可靠的长读长比对的基石，而只有那些能与独特k-mers比对的长读长被保留。在重复密集区域（如着丝粒）中，单拷贝k-mers的间距可以是不规则。例如，在X染色体上两个k-mers之间观察到的最长距离为53kb，这意味着跨越染色体的这一部分需要≥53kb的读长。

对纳米孔读长使用nanopolish软件进行两轮基于k-mer的polish，加上对其它测序平台的长读长polish，然后使用HiFi比对来评估polish是否成功后， Karen表示，完成的T2T X染色体具有从端粒到端粒的结构验证组装，包括了在X着丝粒处的2.8Mb串联重复问题。他们使用的新型基于k-mer的polish策略改善了大型密集重复区域的组装质量, “真正为我们带来了高质量和高连续性”。

Karen最后说到：

“

我们未来两年的目标是获得完整的人类基因组。我们在装配质量和完整性方面为遗传学界提供了越来越高的标准。从2020年及以后，我们需要开始考虑人类群体，而不是单一的人类基因组。这将需要在PromethION上进行越来越高通量的长读长测序，还需要云组装和处理。

”

加州大学圣克鲁兹分校即将发布一款名为SHASTA云组装器，这款组装器已经在5.6小时内完成了2.8 Gb序列数据的组装。

Karen的演讲视频请见我们的后续分享！

London Calling 2019 – Day 3将会分享基因组学与基因组医学的新变革，直接RNA测序等更加精彩的内容！

延伸阅读

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