【精彩回顾】London Calling 2019——Day 3 利用RNA直接测序探索转录组RNA结构
London Calling 2019
Yue Wan 新加坡基因组研究院
Yue Wan是新加坡基因组研究所的主要研究员、Branco Weiss Fellow的成员、EMBO青年研究员和Cifar Azrieli全球学者。她主要研究功能性RNA结构和了解其在细胞生物学中的作用。
Yue首先提到London Calling 2019有很多异构体和差异表达的演讲，她想谈谈如何从RNA分子中获取更多信息。她对RNA如何工作、线性结构之外的其他形式、二级和三级结构感兴趣。Yue以核糖开关为例，解释了细胞利用RNA分子结构的变化衡量并响应基质浓度的变化。
获取RNA分子结构的传统方法是克隆小片段，酶切后采用凝胶电泳分析RNA分子的二级和三级结构信息。这种方法复杂、耗时长、只能分析约100bp的片段，而人类典型的转录本约为2kb。
高通量短读长测序可以同时分析数千个转录本，全球很多实验室采用该方法分析各种生物的RNA结构。然而，短读长测序与凝胶电泳法有一些相同的缺点：不能确定长RNA分子的结构、无法阐明异构体的精确结构。RNA以不同的方式存在于整个生命周期中，而批量的测序只能得到RNA分子的平均结构。此外，高通量短读长测序同样耗时长，且存在许多已知的偏差。
Yue接着解释了直接RNA测序如何解决这些问题：仅在单链状态时，利用不同的化学物质合成单个修饰碱基，如用DNS或CMCT分别修饰A和C碱基或C和U碱基的残基。
Yue和团队想要筛选一些这种化学修饰物，对已知结构进行活性处理，利用纳米孔测序技术平台，对修饰和未修饰的折叠四膜蟲核糖体第2组内含子进行测序。
使用原始数据的平均值和标准差，根据转录本的长度生成修饰图谱。当用这些值定位修饰碱基时，与未修饰的对照组相比，修饰组能够明显的看到的修饰RNA，且整个RNA长分子中修饰RNA峰值与预期位置一致。此外，作为额外对照，对变性和修饰RNA测序表明：整个长分子中，人工修饰表现出更高更统一的表征。在枯草芽孢杆菌的16s rRNA中进行验证，结果显示纳米孔测序与凝胶电泳法结果一致。
Yue指出没有静态的RNA分子，例如在结合到基质上时，TPP核糖开关结构发生改变。使用上述方法可以看到结构的变化，而且信号的强度取决于用于定量的底物浓度。
Yue对15个未修饰和20个修饰的胚胎干细胞系全转录组进行测序。该方法的重复再现性很高，系统中的噪音很低。结果显示人类转录组中的结构特征可以是如特定转录物的5'UTR区域。
Yue接着谈到用这种方法区分不同的异构体。长读长测序可以跨越分段的整个转录物结构，来了解不同转录本之间的关系。那么，结构对于功能有多重要？最后，Yue解释了不同异构体的不同翻译状态下，环己酰亚胺(Cycloheximide)如何终止核糖体翻译，结果是结构差异越大，翻译差异越大。
为期2.5天的盛会圆满结束，对纳米孔测序应用的研究与探讨未完待续，更多的London Calling 2019精彩演讲视频与内容，我们将随后与大家分享。
随着文末的短片感受一下London Calling 2019的精彩内容吧！
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