Nature 子刊 | 新RNA单细胞测序法: 结合纳米孔全长转录本准确灵敏识别全长抗原受体序列

在7月《Nature Communications》最新发表的一篇文章中，澳大利亚加文医学研究所的科学团队开发了一种结合短读长、单细胞和纳米孔长读长的靶向高通量测序方法：RAGE-Seq。

RAGE-Seq使用靶向捕获和Oxford Nanopore技术对全长转录本进行测序，在单细胞分辨率下与短读长转录组分析相结合。这种新方法将基因表达谱与来自大量细胞的靶向全长mRNA序列精确匹配，并通过将转录组分析与来自数千种人肿瘤相关淋巴细胞的全长抗原-受体序列鉴定相结合来证明该方法的强大功效。使用纳米孔长读长的从头组装，可以高精度和灵敏度的识别完整的抗原-受体序列，包括识别干扰B细胞克隆进化的来自免疫球蛋白全长重链和轻链的体细胞突变。

（加文医学研究所将在今年NTT 9.20香港会场演讲）。

背景：

人类细胞多样性可能来自于复杂的基因重排和可变剪接事件，关键DNA重排导致在免疫系统中每个新分化的T淋巴细胞或者B细胞都携带不同的抗原受体­——TCR和BCR。这些淋巴细胞上异常多样的抗原受体控制着细胞的发育、存活和激活。对单个淋巴细胞的BRCs或TRCs与其全长转录组进行并行测序，可以追踪免疫系统在应对癌症、自身免疫反应等疾病时的反应过程。

挑战：

作者在文章中指出，常用的方法每个细胞的价格相对较贵，而使用短读长的组装很难甚至无法破译被超过500个核苷酸分隔的mRNA区段的关键性选择性剪接。目前用于检测单细胞中mRNA差异表达的短读长测序方法依赖于捕获聚腺苷酸化的mRNA转录本，然后合成cDNA、混合、扩增、构建文库后进行短读长 3’ cDNA测序。而这种片段化和短读长的组合无法充分测序重排的TCR和BCR转录本的V(D)J区，该区域位于转录本5' 末端的前500个核苷酸中。这就需要生成能够包含从3’ cell-barcode到5’ V(D)J完整BCR和TCR序列的全长cDNA读长。

解决方案：使用纳米孔长读长生成全长cDNA

为了保留全长转录本，该技术首先采用靶向而非PCR的方法来富集BCRs和TCRs的cDNA转录物。接着利用纳米孔长读长测序技术进行全长转录组测序，结合短读长技术，通过匹配的条形码，链接每个个体的转录组的全长抗原 - 受体序列。能够高准确度和高灵敏度的识别全长抗原受体序列，追踪与癌症免疫反应相关的免疫细胞。

图：RAGE-Seq工作流示意图（来源于原文）

研究人员利用不用的平台对三阴性乳腺癌患者的肿瘤和淋巴结的7138个细胞样本进行了RAGE-Seq测试验证，以追踪扩增的淋巴细胞克隆的转录组图谱，探究免疫系统细胞如何应对癌症。结果显示，RAGE-Seq能够有效识别肿瘤和淋巴结组织中的免疫细胞，证明了RAGE-Seq检测人体组织中体细胞超突变的能力，并发现患者肿瘤的免疫反应具有独特的遗传特征和组织特异性富集。

其中，从纳米孔测序平台共获得20,346,396 个读长，其中42.9%的序列能够唯一比对到TCR和BCR恒定区域，与非目标捕获的短读长测序数据相比，富集度约为13倍。对于Jurkat和Ramos细胞，纳米孔条形码回收率(barcode recovery)分别为99.3%和100%。

图：来源于原文

该团队现在正将该技术应用于黑色素瘤患者的样本，以了解为什么接受免疫治疗的患者中有一半的反应较差。研究人员认为，该方法也可用于更好地了解自身免疫性疾病和炎症性疾病。

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