Happy RNA Day! Nature 综述： RNA测序科技 | 7大纳米孔社区RNA & 转录组突破破

昨天是2019年刚刚过去的RNA Day，不妨让我们花点时间来看看RNA测序技术的发展，庆祝一下Nanopore社区在转录组学领域的一些突破性工作吧！

要点：

• 长读长/超长读长，唯一能直接测序RNA的技术

• 全长转录本明确鉴定剪接变体和基因融合

• 使用直接cDNA/RNA测序消除PCR偏好性

• 准确鉴定和定量转录本和异构体

• 快速、实时地测序和分析
  

• 通过直接RNA测序：在核苷酸测序的同时检测碱基修饰

• 根据需求使用MinION、GridION或PromethION拓展规模

Nature 综述: RNA测序科技

基于短读长技术的RNA测序方法提供了超越传统微阵列方法（Microarray-based methods）的优势，而最近长读长cDNA测序和直接RNA测序技术的进展则让科学家们能揭示此前无法解答的问题。在上周刚刚发表于《Nature Reviews Genetics》期刊的综述中，剑桥大学的James Hadfield博士对短读长、长读长cDNA和直接RNA测序三种不同方法的区别和优势做出了清晰的描述（下图所示）。

图来源于《Nature Review Genetics》

doi: 10.1038/s41576-019-0150-2

James Hadfield博士在综述中提到，在短读长cDNA测序中有很大比例的读长定位模糊，这种局限在正确识别和定量基因的多种异构体表达上尤为明显。例如，在人类转录组中存在非常长或高度可变的转录本异构体，其中50%的人类转录本长度大于2500bp。长读长cDNA方法可以产生横跨异构体的全长转录本读长，去除或大幅减少假象和模糊定位，改善差异异构体的表达分析。而直接RNA测序能够进行全长异构体分析，还能同时检测碱基修饰，如N6-甲基腺苷(m6A)和poly(A)尾长估计。

纳米孔测序身兼长读长/超长读长，能够对差异表达基因进行定性和定量的分析，并且是目前唯一可以直接测序RNA的技术。

纳米孔cDNA和RNA测序的升级：

低起始量，高产量：使用新版直接cDNA 109测序试剂盒，目前在1张MinION测序芯片可获得>500-1000万条全长转录本，在1张PromethION芯片可获得>3000-6000万条全长转录本。（技术不断升级中）

详情看视频：

https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?width=500&height=375&auto=0&vid=f0843oejurp

试剂盒对比和MinION芯片典型通量：纳米孔直接RNA，直接cDNA, PCR- cDNA测序（拓展规模可使用GridION或PromethION）

节选7个来自纳米孔社区的突破：

1. 注释(Annotation): 全长纳米孔cDNA测序，所获转录组多样性增加四倍

使用纳米孔长读长测序获得的全长转本提高了从头转录组组装和新型异构体的发现。Anthony Bayega博士使用全长纳米孔cDNA测序，与NCBI预测相比，获得的发育中的橄榄蝇的转录组多样性增加了四倍。

doi: https://doi.org/10.1101/478172

2. 非编码RNA：62％转录成新RNA的靶向单倍型域(haplotype block)未收录在GENCODE注释

大多数与神经精神特征相关的SNPs可能存在于非编码区域的非编码RNA中。Hardwick等人在PromethION上使用靶向RNA捕获和长读长cDNA测序来研究疾病相关区域中的新型RNA表达，识别出远端外显子之间的剪接，并且整体表现出比短读长序列更均匀的外显子覆盖。

doi: 10.3389/fgene.2019.00309

3. 转座因子：通过纳米孔长读长cDNA测序增强重复序列的分辨率

由于转座因子的重复性，使得用短序列读长进行定位具有挑战性。在Jiang等人今年4月发表在《RNA》期刊的文章中，作者对天然RNA进行了5'Cap捕获，用于纳米孔直接测序全长转录物，准确鉴定出蝗虫转录组中的RNA剪接形式。

https://doi.org/10.1080/15476286.2019.1602437 

4. 基因融合：MinION和Flongle cDNA 测序在数小时内检测基因融合

美国麻省总医院的William Jeck博士和团队在MinION上使用实时cDNA测序，研发了一种快速经济的基因融合检测方法，在测序开始的“数秒内”就检测到了第一条融合基因，测序15分钟内便得到>100条全长转录本，鉴定出急性白血病的BCR-ABL1融合基因。William Jeck 博士证明了纳米孔测序有潜力在将来显着降低这些疾病的关键治疗时间。

https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2018.08.003

5. 单细胞：纳米孔长读长在碱基水平解析抗原受体序列

传统的高通量单细胞测序仅限于cDNA分子末端的短读长序列。为了能够在单细胞水平上完全解析转录本，Mandeep Singh等人开发了一种对淋巴细胞转录物的纳米孔长读长和单细胞测序结合方法。研究来自乳腺癌患者的样本，他们以“核苷酸分辨率”解析了抗原受体并研究淋巴细胞克隆进化。

doi: 10.1038/s41467-019-11049-4

6. 碱基修饰：使用纳米孔直接RNA测序在天然RNA中检测m6A

Oxford Nanopore提供唯一能够直接测序天然RNA而无需转化为cDNA的技术。利用这一点，Eva Maria Novoa和她的团队开发了一种准确检测m6A修饰方法，显示对天然RNA中细胞分化和应激反应等过程至关重要。

doi: https://doi.org/10.1101/525741

7. RNA病毒基因组：以100％核苷酸覆盖率首次以天然形式测序完整RNA病毒

Keller等人利用直接RNA纳米孔测序对编码完整的甲型流感病毒基因组进行测序，这也是第一个以天然形式测序RNA病毒基因组的例子。他们获得了100％的核苷酸覆盖率和99％的共识同一性，并指出他们的方法能够用于测序病毒mRNA及其他病毒病原体。

https://doi.org/10.1038/s41598-018-32615-8

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Happy RNA Day! 另祝大家周末愉快！

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