百迈客Nanopore全长转录组实测数据汇总

经授权全文转载自百迈客基因公众号

忽而今夏，恍若流年。不知不觉，从去年百迈客与Oxford Nanopore Technologies公司达成长期合作（百迈客与Oxford Nanopore公司合作-斥巨资引进Nanopore全测序平台）至今，已经整整一周年的时间。在这一年时间中，有过质疑，受过诋毁，但也因此迅速成长。Nanopore全长转录组的推广，在业界激起了千层浪。在这一年的时间中，小编见证了各个部门的积极全力配合，从生产到研发，投入大量的人力物力，一步一个脚印，不断更新优化流程，以更高、更新、更优的技术服务广大客户。

为了纪念Nanopore全长转录组面市一周年，请跟随小编的脚步，一起来看看这一年转录组方面的技术成果和实测数据吧！

质量篇

Nanopore在经过软件算法的更新升级后，对下机的raw data过滤短片段和低质量数据，其统计结果如下表所示：测序物种数据量在6G~20G左右，其N50在1500bp左右，测序的平均长度在1~2kb之间，平均质量值Q9以上。

表1  数据质量统计

 定量分析篇

01

饱和度统计

Nanopore平台融合了二代和三代的优势，其既可对转录本和基因进行定量分析，也能进行可变剪接等基因结构的鉴定。其中，能够准确定量的重要原因之一就是，测得的数据能够达到饱和。对于Nanopore全长转录组的不同测序数据量，我们均评估过其测序数据的饱和度。

在基因层面，无论是2G还是常规6G，对于二倍体来说，除极低丰度表达基因未达到饱和外，其他表达水平的基因均可以测得饱和，这与二代的数据饱和度相似。而对于多倍体生物，尤其是异源多倍体生物，若想让数据达到饱和，则需要加大数据量才能满足后续分析要求。实测数据饱和评估图如下。

图1 数据饱和度评估

02

不同物种转录丰富度

全球物种成千上万，进行科学研究的物种，也是多种多样，物种基因组大小由Mb到Gb不等。然而，不管基因组相差多少倍，从转录组水平，我们可以看出，差别都是在Mb级别。因此，对于常规二倍体来说，不管基因组多大，在2G左右测序数据量的情况下，除极低表达丰度的基因外，其他基因基本能达到饱和水平（实测数据如下图所示）。

表2 物种转录组丰富度统计

图2 不同物种饱和度统计

03

表达量分析

在这一年中，我们推出过不同测序数据量的Nanopore全长转录组测序，无论2G、4G还是6G的数据量，其基因层面表达量的相关性均在0.999以上，这表明从2G开始，定量结果不会随着数据量的增加而发生变化。同时ONT平台和Illumina平台在基因表达量上也具有高度的相关性，相关系数大于0.8。

图3 表达相关性统计

Nanopore除了和二代一样，能在基因层面进行定量外，还能对同一基因的不同转录本进行定量分析。

众所周知，二代测序由于测序读长短，会存在多比对效率问题，尤其是对不同基因间存在的高度保守区域，短reads无法区分到底是来源于哪个基因，从而使得鉴定模糊，而长读长测序，由于其测序读长长，可以跨越5'端到3'端的全长转录本，从而使得多比对效率极低（与基因组多比对效率1%以下）。与此同时，二代测序由于测序片段短，且存在桥式扩增，会有GC含量和PCR碱基偏好性，在定量上并不能真实的反映转录本的表达情况。我们通过实测数据，将Nanopore与Illumina平台进行比较，发现Nanopore测序数据的GC含量偏好性要明显小于Illumina，因此，ONT平台可以更真实的反映生物体内转录本的表达情况，定量更为准确。

图4 利用二代与Nanopore平台组装全长转录本  （ONT官方白皮书）

图5 GC含量偏好性

04

差异表达分析

由于Nanopore可以定量，因此使用该技术，既可以找到差异表达基因（DEGs），也能鉴定差异表达转录本（DETs）。通过实测数据，我们将同一物种在不同平台的检测结果进行统计分析，发现其鉴定到的基因总数基本持平（2G ONT (20,990) vs. 6G Illumina (21,158)），而两个平台鉴定到的共同差异表达基因，其上下调关系完全一致。

表3 ONT与Illumina平台在相同数据量下差异表达基因鉴定

   基因结构篇   

01

转录本数量和种类的鉴定

通过实测项目可得，目前Nanopore全长率基本在70%以上，全长率较高，且过滤后的clean data与基因组比对效率高于80%，比对效果优于二代测序技术。

表4  不同物种全长转录本鉴定

此外，在某植物物种中，该物种同时做了Pacbio三代和ONT三代比较分析，通过测序数据发现，2G 的Nanopore测序技术鉴定到的转录本总数与20G的Pacbio鉴定的全长数量持平，经注释分析后，ONT平台鉴定到的已知基因数和新基因，其数据丰富度要高于Pacbio平台。

表5 ONT与PB平台鉴定全长转录本水平比较

02

基因结构准确鉴定

与二代相比，Nanopore全长转录组不仅可以鉴定可变剪接类型，同时还能将不同剪接类型的全长转录本呈现出来，这是二代所不能比拟的，其在可变剪接、融合基因等结构分析鉴定，更为精确和丰富。如下图所示，在鉴定可变剪接转录本方面，除了可以鉴定到基因组已知转录本，还能鉴定到很多新的转录本；同时数据统计可得，动物中可变剪接事件以外显子跳跃为主，植物中以内含子保留为主，该结果也符合前人已有报道。

图6 人基因结构鉴定

图7 可变剪接类型鉴定

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