厦门大学方柏山/洪文晶/王斌举团队Nature Catalysis!
本文来源 | 小柯化学
北京时间2023年3月7日，厦门大学方柏山教授团队、洪文晶教授团队和王斌举教授团队合作在Nature Catalysis期刊上发表了一篇题为“Catalytic cycle of formate dehydrogenase captured by single-molecule conductance”的研究成果。
研究团队通过研究单分子辅酶依赖型甲酸脱氢酶催化甲酸的循环过程，提出了辅酶依赖型氧化还原酶自组装地与其辅酶结合、结合的NADH通过原位氢化物转移反应直接转化为NAD+，而非经典的Theorel-Chance机制所设想的酶催化前后辅酶与酶各自游离，可望确立辅酶依赖型氧化还原酶催化新机制。
论文的共同通讯作者是洪文晶、方柏山、王斌举；共同第一作者为张瑷珲、庄小燕、刘佳、黄佳城。
单分子电导监测甲酸脱氢酶催化反应示意图及其催化新机制
酶是生命体中一大类重要的行使催化功能的蛋白质机器。它们不仅为细胞代谢过程提供各种还原力和能量，也是生命活动信号调控中的接受者和传递者。毫无疑问，了解酶的功能和催化机制是生命科学领域研究的重要使命。
自从1951年Hugo Theorell（因发现氧化酶的作用机理于1955年获得诺贝尔生理学或医学奖）与Chance（获诺贝尔奖提名）共同提出了著名的辅酶依赖型氧化还原酶催化的Theorell-Chance机制以来，有关辅酶依赖型氧化还原酶的催化机制的研究一直是热门话题。
然而，系综平均的群体研究方式仍然是酶催化过程的主要研究手段。由于缺乏单分子水平上系统分析酶催化反应过程的表征方法，通过实验解析酶催化机制仍然是生物科学、生物技术、生物工程乃至生命科学领域研究的巨大挑战。
方柏山1997年主持国家自然科学基金项目“基于荷电膜、辅酶再生多酶连续催化过程研究”以来，长期从事辅酶依赖型氧化还原酶的研究。自从2001年他在实验中惊奇地发现甘油脱氢酶催化过程辅酶的氧化型与还原型频繁转化的离奇现象后，便对著名的Theorell-Chance机制产生质疑，并开始专注于其新机制的研究；于2003年突发奇想：用含有胞内氧化还原酶的细胞直接替代需要经过细胞破壁等一系列复杂过程获得的酶考察其酶的活性，又惊奇地发现：不破壁的细胞可直接测得其胞内氧化还原酶的酶活，从而大胆地提出新机制的设想：辅酶依赖型氧化还原酶催化的起点应该是组装有辅酶的氧化还原酶，经催化转型后的辅酶通过质子和电子的快速转化原位再生；随后通过创新性地设计辅酶固定化法、电化学法对所提出的机制予以不同侧面的佐证，并提出了基于酶单分子研究酶催化机制和佐证所提出的催化过程辅酶原位再生的科学思想。随后与从事扫描隧道显微镜断裂连接（STM-BJ）仪器组装和应用的专家洪文晶教授合作对所提出的机制开展单分子水平的佐证研究，首次揭示了甲酸脱氢酶与辅酶NAD+结合的导电性。在前期一系列研究的基础上，以“NAD(P)H依赖型氧化还原酶的导电性和催化新机理研究”为题申请国家自然科学基金并获得资助。在后续的研究中又与擅长化学计算的专家王斌举教授开展合作，终于在方柏山所指导的张瑷珲博士后、庄小燕博士生、黄佳城硕士生以及团队其他成员联合攻关下取得了如下可喜的成果。
课题组采用单分子扫描隧穿裂结（STM-BJ）技术作为表征手段，成功建立了基于单分子电学表征的酶催化过程研究平台。以甲酸脱氢酶（FDH）作为研究对象，研究结果表明其分别结合还原型或氧化型辅酶I后呈现不同的电导值。这种现象不仅可用于区分甲酸脱氢酶催化循环中的不同反应状态，而且可用作监测甲酸脱氢酶催化循环轨迹的标记。基于人工智能的电导数据分析和统计结果表明，甲酸脱氢酶催化循环过程与传统的Theorell-Chance机制不同，其催化结束时不经历辅酶解离状态。结合多尺度模拟，研究团队提出反应结束后结合在甲酸脱氢酶中的还原型辅酶I通过氢负离子原位转移直接转化为氧化型辅酶I，并直接开启新的催化循环。该研究表明，新鲜NAD+可以很容易地扩散到FDH中NADH的附近，导致NAD+和NADH的两个烟酰胺部分之间的π-π堆叠相互作用。然后，新生成的NADH可以通过与新鲜NAD+的原位氢化物转移反应转化为NAD+。与实验结果一致，该计算表明NADH的酶结合亲和力比NAD+强得多，这表明通过辅酶解离状态的直接位置交换是非常不利的。
图1：STM-BJ测量单分子FDH结的电导
图2：使用STM-BJ的悬停模型监测单分子FDH反应动力学
图3：使用QM(B3LYP-D3)/MM-MetD计算吉布斯自由能
该项工作首次在单分子尺度下观测到酶催化反应动态过程，并结合多尺度理论计算提出了单分子尺度下甲酸脱氢酶催化新机制。该研究建立了包括单分子测试、数据分析和多尺度模拟为一体的完整单分子酶学研究平台，将为后续的单分子酶促动力学、酶的设计、改造和应用等研究开辟新的思路。所提出的辅酶依赖型氧化还原酶催化新机制既是对沿袭70多年的Theorell-Chance机制的革新，又可望更新传统的全细胞发酵、多酶耦联催化、酶活性检测、生物传感器等技术，这不仅具有重大的科学意义，而且具有广阔的应用前景。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41929-023-00928-1
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